k****o
发帖数: 589 | 1 以前还没遇到这种情况。用Pfaffl法做的10倍梯度稀释标准曲线。样品是用trizol提取
的RNA逆转录
而成的cDNA,RNA的260/280 ratio大于1.9。PCR跑出来melting curve形状良好。
negative
control一切正常。
一个基因是18S，用IDT在线程序做的primer。效率75％，标准曲线R^2>0.99，Ct范围20
～35。
另一个目标基因，同样方法设计primer。效率200％，标准曲线R^2>0.98,Ct范围20～35。
试过踢走标准曲线中的某些数据点，不解决问题。
不知道是不是机器出问题了？包子答谢。 | h******y
发帖数: 351 | 2 引物特异性不好？
20
35。
【在 k****o 的大作中提到】
: 以前还没遇到这种情况。用Pfaffl法做的10倍梯度稀释标准曲线。样品是用trizol提取
: 的RNA逆转录
: 而成的cDNA,RNA的260/280 ratio大于1.9。PCR跑出来melting curve形状良好。
: negative
: control一切正常。
: 一个基因是18S，用IDT在线程序做的primer。效率75％，标准曲线R^2>0.99，Ct范围20
: ～35。
: 另一个目标基因，同样方法设计primer。效率200％，标准曲线R^2>0.98,Ct范围20～35。
: 试过踢走标准曲线中的某些数据点，不解决问题。
: 不知道是不是机器出问题了？包子答谢。
| k****o
发帖数: 589 | 3 引物应该没问题。一是melting curve形状接近完美，没有小肩峰，融解温度也正常。
另外设计的时候考虑到了dimer的问题，已经加以避免了。blast的结果表明这些引物顶
多和genomic DNA有部分序列吻合，和其他基因的mRNA序列都不吻合。
所以我在想会不会是机器的问题。不过机器的基线倒是挺稳的。用的SYBR Green,噪声
产生的RFU变化不超过正负100。 |
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