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Biology版 - 请教:如何灵敏检测 40-50 nt viral RNA
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z**m
发帖数: 50
1
本人生物菜鸟,请教版上牛人,万分感谢!!!
想检测老鼠体外培养细胞中病毒感染前期,病毒RNA是否和目标蛋白结合成RNP complex。
目标蛋白IP抗体available,想检测的viral RNA 为40-50 nt的leader sequence (
LeRNA)。
做了些homework,准备用目标蛋白pulldown,PK处理,纯化RNA组分,northern检测。
问题:
1)由于个人原因,不想用同位素标记探真做northern,不知可否用dig-probe做
northern,主要担心RNA量太少,不知道dig的灵敏度是否足够。
2)由于目标RNA只有40-50 nt,请问northern 的DNA或RNA probe是否只能是这40-
50nt的序列?如果probe只有40-50 nt,是否太短?尤其是用dig-UTP标记?可否适当
延长probe至200 nt-300nt(后续sequence是病毒的另外一个高表达基因,如果该基因
mRNA也和目标蛋白结合最好,如果不和目标蛋白结合,是否延长的probe检测不到40-50nt的leRNA?)
3)除了northern,
a***e
发帖数: 1010
2
(1)try p32 probe, that's better than dig-probe. try use StarFire kit to
increase the sensitivity of your probe (~10x).
(2)40-50 nt probe is more than enough. People can usually blot small RNAs
with 20-30 nt probes (after StarFire labeling)
(3) you can try Tagman-qPCR or splinted-ligation assay, or LNA probe to do
northern blot
(4) deep sequencing w/ or w/o cloning
z**m
发帖数: 50
3
谢谢了!能再请问一下tagman-qPCR具体有什么注意事项吗?LNA probe是不是可以避
免同位素?包子感谢了!

【在 a***e 的大作中提到】
: (1)try p32 probe, that's better than dig-probe. try use StarFire kit to
: increase the sensitivity of your probe (~10x).
: (2)40-50 nt probe is more than enough. People can usually blot small RNAs
: with 20-30 nt probes (after StarFire labeling)
: (3) you can try Tagman-qPCR or splinted-ligation assay, or LNA probe to do
: northern blot
: (4) deep sequencing w/ or w/o cloning

a***e
发帖数: 1010
4
haven't used taqman-qPRC myself.
LNA probe is still p32 labeling, haven't tried that myself either.
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