s********n
发帖数: 2939 | 1 在我的印象中所谓治理不相容是指两个质粒利用相同的复制机制进行复制，在初期它们
是可以一起复制的，但是当这两个质粒存在一些差异（比如大小或者质粒上基因对宿主
的影响等）时，某一个质粒会有复制优势（比如质粒比较小或者质粒上的基因有利于宿
主生长等），从而导致这个质粒对于另一个质粒而言有复制优势，最终占优势甚至把另
一个质粒淘汰。
但是如果有两个选择压力的话这两个质粒应该可以共存，但比例和抗生素浓度相关。
a |
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g***j
发帖数: 40861 | 2 正在构建一个质粒，挺简单，就是把这个质粒上的gfp换成同样大小的dsRed,质粒的骨
干不变。
连接，转化以后，有不少菌落。
第一天挑了4个菌落，长在LB里，amp浓度100ug/ml.结果只长了一个。试剂盒提质粒，
solution3 以后离心，结果上清非常浑浊，白色的东西离不下去。继续做，提完，跑胶
，没质粒。
第二天，又挑了4个菌落，长在LB里，amp浓度50ug/ml。4个都长了，试剂盒提质粒。同
样，solution3 以后离心，结果上清非常浑浊，白色的东西离不下去。继续做，提完，
跑胶，都有质粒。质粒大小和原质粒dimer 一样大。单切，跑胶，3个切不开，1个切开
后和原质粒单切大小一样。更加确定是形成dimer了。
问题一，为啥会形成dimer呢？
问题二，我是重新做连接，转化呢？还是把那个能切开的切一下，然后稀释，连接，再
转化呢？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 3 同事之前收到别人给寄过来的质粒，已经是大提好了的。送测序公司简单测了一个反应
，匹配。
后来同事基于这个质粒又构建了其他几个衍生，测序据说也都啥没问题。后来再做酶切
时，顺便点了个质粒对照，结果问题来了。
单酶切，双酶切，片段大小都正确。单单这个未酶切的质粒对照，不是正常超螺旋质粒
应有的迁移速率快于线形片段的情形，反而显示条带还显著大于单酶切后的线形片段。
（质粒大小6.5kb，正常的超螺旋结构约3.5-4kb,而该未切质粒显示8kb）
同事今天找我讨论，想了半天没法解释。从来没遇到这种情况，确切地说很少做质粒对
照，单双酶切正确就完了。没想到还有这种情况，怎么解释？ |
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发帖数: 1 | 5
hffmsb4 (Hua) 说韩春雨提供给其它实验室的Ago质粒不带tag，而NBT文章上的Ago
上有tag。
“其实从他在这（遗传所）听说了C端带tag Ago没活性，做贼心虚把不带tag的Ago
质粒，而不是自己用来做实验的Ago质粒发到Addgene，谜底就已经揭晓了。。。”
这个事情如属实， 问题就严重了。
怪不得NBT强调：“作为在自然科研旗下期刊发表论文的条件之一，作者须将材料、
数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供，不可加以不当限制。”
看看， 材料在第一位的。
现在大家手上都有韩春雨提供的质粒，看看他重复时使用什么质粒。
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g*******e
发帖数: 156 | 6 如果质粒A与质粒B不兼容。
我把质粒A整合在了染色体上面，那么质粒B能不能在这个染色体上整合了质粒A的宿主里面复制？
我觉的是应该可以，确认一下。Thanks! |
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s******s
发帖数: 13035 | 7 最近用Roche的Nick Translation Mix碰到问题了。我原来中抽的质粒
没问题，rxn完了大小大概200－400Nts。最近抽的同一个质粒酶切看起来
正常，一做Nick Translation就切碎了，小于100 Nts. 换了几种质粒kit,
用了DH5a, TOP10, Stbl3，都不行，但是control质粒正常。我怀疑质粒
不干净，所以用Phenol抽过，还是不行。请问大家有什么建议？ |
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m*********7
发帖数: 606 | 8 我建议你先小提看看。
见过一个很极端的例子，某个质粒小提时没有任何问题，一扩大培养基体积细菌就产不
了多少质粒。那个实验室每次提质粒时就只好上１００个试管，再合起来提；或者铺一
大块琼脂培养基，等菌苔长满再刮下来提。
那个实验室的PI和别人讨论觉得可能是插入序列有未知潜在抑制作用，但谁也不知道原
因，只好先这么做了。
另外，很早以前有些老质粒是需要在培养过程中用 IPTG诱导的。你看看质粒信息是否
有这种可能性存在。 |
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b***2
发帖数: 348 | 9 准备往细胞里转染一个基因。现在我们有一个普通质粒，pGL的。但是老板现在想做病
毒转染。我的理解是这种质粒没有病毒包装的信号，因此必须克隆到病毒质粒上。但是
去问了一个做慢病毒的人，他说随便什么质粒都可以，因为包装质粒和壳质粒已经带信
号了。我现在非常奇怪，上来问问，真是这样的吗？要是这样都行，岂不是随便什么
rna都能往病毒里放？ |
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s***t
发帖数: 204 | 10 有个在法国的PhD学生和我要质粒，这个质粒是我之前文章发表的。如果需要这个学生
的老板写推荐信的话，是否应该让他老板直接给我写信要这个质粒呢？怎么跟这个学生
说呢？还是就直接给这个学生，然后到时候跟他老板要推荐信的时候说给过他学生质粒
？ |
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A*******e
发帖数: 284 | 11 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 12 我抽的一些质粒，尺寸在15kb以上，把它们放到一般的琼脂糖电泳（0.8-1%）上去跑，
跑出来的结果，往往不是常见的开环和超螺旋的样子，而是几条带，目前还没有找到这
几条带的分布、亮度、出现频率和电泳时间、电压、胶浓度、上样缓冲液、上样量等等
之间的关系。看上去就好像质粒自己断裂成小片段了的样子。但是酶切鉴定，却没有杂
带，说明质粒是完整的。QIAGEN的手册上说，对于像BAC这么大的质粒，开环的会跑得
比超螺旋还快。我的15kb也没到BAC的程度，难道发生了同样的现象吗？
不知谁有类似经历的，分享下经验。多谢！ |
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r*****t
发帖数: 4793 | 13 连接后转化，有菌落长出，但是提不出质粒
我试了买的感受态细菌和自己做的电转的菌，都是一样的结果，有菌落，提不出质粒
提质粒用的是ｑｉａｇｅｎ的ｍｉｎｉｐｒｅｐ，应该没问题
摇的菌好像不太对，长的不够浓，离心下来只得到一点菌，而且看起来不太对劲，比较
＂粘＂，正常离下来的像一堆沙子，这个像粥
还有就是我的载体质粒比较大，有１４ｋ
到底怎么回事啊？愁死我了 |
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b**********8
发帖数: 349 | 14 我以前也碰到过这个问题，你那个产量低的vector是什么？
我曾经碰到两个质粒，一个是基于pECE的表达质粒，另一个是用pMir-reporter 做的一
个基因的3‘UTR报告基因质粒，这两个质粒做midiprep的产量每次最多只有30ug，换感
受态都不行，老板还总以为是我自己的问题，后来换了别的人提，也是同样的问题 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 按照我的理解，质粒大部分时间都是在细胞质里漂着的，接触到组蛋白的机会很少。特
别是，组蛋白包装的时期是S期。那个时候核膜还是完整的，质粒没有太大的机会进入
核内部，所以包不起来。
至于复制，另外一个同学已经讲了，大部分质粒缺乏真核的复制起点。唯一的特例就是
被病毒感染过的细胞（比方说293T），这个含有病毒的复制因子所以可以小规模的复制
含有SV40 复制起点的质粒。 |
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n********e
发帖数: 50 | 16 可问题来了。addgene会从他们卖的质粒中获利。如果addgene只管收质粒，随便卖不用
付什么责任的话，那这个生意岂不是太容易做了？就算不全是addgene的错，好歹我们
的实验证实质粒有问题，他们应该深入查查以免其他人买同样有问题的质粒浪费时间金
钱，可是他们的原则反正死活你的实验有问题，这点很让人不爽。 |
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a*******e
发帖数: 245 | 17 You got it!
addgene 本来就是一个挂着所谓的非盈利的招牌，但确是钱挣得大把大把
另一方面它又的确提供了很多方便
为什么没有人搞一个比较好的质粒储存库呢，客户保质保量，还可以给提交质粒的人分
成，岂不更好
65刀的无保证质粒，和150刀的高质量质粒，很多人应该更倾向于150刀的吧 |
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D******e
发帖数: 18 | 18 本人现在注册成立了一家生物公司，不方便再从Addgene购买质粒。能否烦请论坛的朋
友帮忙从Addgene购买若干质粒。我将付双倍价钱，质粒小提后分享全部所购买质粒。
有意者请私信给我！十分感谢！ |
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q*****d
发帖数: 445 | 19 为什么这个质粒上的信号肽序列说是从酵母里来，但是蛋白序列确有几个氨基酸的差别
？我想用我的酵母分泌表达几个蛋白，应该是以酵母MF(ALPHA)前270bp的序列为准，还
是以pPIC9K质粒上的信号肽序列为准？我想是不是因为pPIC9K质粒主要是以P.Stiplis
为宿主，所以有几个氨基酸的优化。还望明白人给解释一下，以便我进行引物设计，谢
谢！ |
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b******n
发帖数: 4225 | 20 呵呵，抽质粒老手也碰上这种奇怪的事情
某种Gram-菌的一个isolate/strain，通过conjugation转进了shuttle vector之后
抽质粒用的是Qiagen mini-prep kit
跑电泳发现是很亮的smear
作为对照，该种菌的另外一个isolate/strain同时进行了conjugation和plasmid
extraction得到了清晰的质粒超螺旋条带
做了几次都是这样
现在有点迷糊，不知道可能的问题所在
谢谢指点 |
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h*******0
发帖数: 14 | 21 正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
率。轻高手指教一下，谢谢。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 22 你可以试试低熔点胶。
正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
率。轻高手指教一下，谢谢。 |
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k********u
发帖数: 2209 | 23 看你的实验设计。如果只是想把质粒整合到基因组里面，一次cross-over，
质粒是插进基因组的。你的示意图，第二步，酶切后的质粒依然呈环状，
与宿主菌上的同源序列配对，然后cross-over。 |
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z*********o
发帖数: 1091 | 24 插一个1.5 kb 的片断到pUC 载体中,克隆PCR 可以得到几个positive克隆, 而且在含有
抗生素的LB中生长正常,可就是都提不到质粒. 提取质粒的过程没有问题,因为同时提了
其他的质粒, 一切正常.有人遇到过这种情况吗? 真是太郁闷了! |
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s******s
发帖数: 13035 | 25 1.首先你要保证你大瓶摇出来的菌和小摇出来的有一样多的质粒，
用大摇的菌取出来小抽一下看看？
2.不放心iso-pro沉淀的时候－70放一个小时先
3.强烈建议用50ml falcon tube做收集离心，干净，pellet清楚
注意速度不要超过6k，可以时间延长一些
Qiagen的Midi简直是最好的plasmid kit, 质粒绝对干净。以前实验
室做transgenic fly, 只有这个做出来的质粒打embryo不会有很高的
致死率 |
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A*******e
发帖数: 284 | 26 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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r**i
发帖数: 514 | 27 dna纯度对酶切效率有影响。
最好每次不要切很多，可以分多份切。
也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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s********n
发帖数: 2939 | 28 谈到质粒不相容的问题，我一直有一个疑问就是：如果有两个不相容的质粒，但又不同
的antibiotic genes，将其转入同一宿主，同时用抗生素选择的话，这两个质粒应该还
是能够存在的吧？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 29 我们也想到过可能是dimer或者双环套叠，因为迁移速率刚好是超螺旋质粒的2倍，但是
不太懂这个在复制过程中是怎么形成的，而且条带很单一很纯，如果是套叠感觉应该是
mixture才对。
nicked plasmid可能性也不大，首先是新置备的质粒，而且胶上也能在主带后看到微弱
的nicked条带。如果主带是nicked plasmid，大小也不对（和其他衍生质粒的nicked
条带对不上）。
gDNA的污染可以排除，因为可以被完美的酶切鉴定。
确实很奇怪，有谁也遇到过类似情况吗？感觉双环套叠的可能性最大，能解释一切现象
，但是不明白怎么形成的。 |
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e****l
发帖数: 204 | 30 请问大家有么有用过质粒提取公司的服务啊？
我最近要提取约1000个质粒，之后用于 in vitro protein tranlation.
因为质粒的浓度和纯度要求都较高，实验室里用的 High throughput 方法提的不大合要
求。看网上好像有提供类似服务的公司。不知大家有没有用过类似的服务。如果有的话，
想请教一下。
谢谢。 |
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a*****v
发帖数: 128 | 31 小弟最近从Addgene上购买了几个质粒，最初觉得都是发表的文章的质粒，应该没啥问
题，就随便用Addgene的基因blast一下，发现我跟我要的target匹配就结束了。
过了两天仔细一看，居然少了20几个氨基酸，其他才是完全匹配，这帮狗日的怎么用这
样的质粒发的文章啊？
我要不要写信询问一下那个发文章的人啊？
这我买回来，岂不是还要给他们把那20几个氨基酸补上去啊？大侠们有什么简单的办法
么？ |
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d***y
发帖数: 1850 | 32 incompatibility是指两种有相同origin 的质粒不能共存
至于同一个质粒细菌里有多少个copy，跟这个质粒是low copy还是high copy有关，不
过一般都不止一个copy |
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q*****d
发帖数: 445 | 33 我是做合成生物学的，想构建一个新的代谢通路，需要表达很多基因，但是不知道酵母
细胞转化质粒的大小上限是多少？比喻一个30KB的质粒能够通过LiAc方法转化吗？BTW:
我做过最大质粒整合是15KB的。 |
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c*******0
发帖数: 190 | 34 最近在研究一个核蛋白的功能，需要用到GFP-tag的质粒转染...实验室只有含小鼠序列
的质粒，试过转染到Hela和MCF7细胞表达都比较好...而且这个蛋白在小鼠和人的同源
性在95%左右...求问用这个质粒做出来的结果投稿会被拒么？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 35 对，你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种，
而中提是在已经长起来的液体里接种。
其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携
带质粒的菌，顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的
地盘，所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了，突变体很快就能取
代携带质粒的菌体，因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的
，都是个负担。
有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈，然后长起来后把整层都
刮下来放到培养液里去再摇个８小时就可以做中提了。 |
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B****w
发帖数: 48 | 36 我有一个质粒6KB左右，用PCR扩增了其中一个1KB的片段，然后用这个1KB的片段作
primer，直接扩增整个质粒，用高保真的酶，就相当于QuikChange，是否可以扩增整个
质粒？ |
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y******s
发帖数: 92 | 37 这个问题是老问题了，自己真正碰到又成问题了。
想运输50管左右的含有质粒的细菌或者质粒本身回国。点滤纸的方式量比较大不太方便
。如果是50个ep管的质粒随身携带有点目标太大，如果万一被查需要做什么准备？另外
有没有谁通过正规途径运输回去的？大致流程怎样？
运输小鼠的代理公司哪个比较好，也请推荐一下。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 38 质粒好像没有真核复制起始位点吧？应该不能复制。
Histone deposition我也一直很好奇，不知道哪里有这方面的信息。
另外一个问题就是进入细胞的质粒的量的问题。我们普通做瞬转，如果假定转染效率是
100%，那么进入单个细胞的质粒数目大概能达到上亿的数量级。这是很夸张的一件事，
除非转染效率低得离谱。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 大部分质粒，其实都是要等细胞分裂的时候趁机进入核的。
所以大部分质粒转录需要细胞有分裂过程。如果细胞根本不分裂，那么质粒上的蛋白就
基本上没有办法表达。
某些病毒的DNA除外, 他们有办法在非分裂期进入核。 |
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S***a
发帖数: 257 | 40 我刚遇到类似的问题解决了，希望解决方案对你有帮助。
我的质粒表达hairpin shRNA,对细菌有毒性。涂板的时候克隆长出来没有问题，但是摇
菌的时候长的不好，拿到的质粒dna浓度很稀。
我是买来的质粒，所以打电话问了公司客服。他们建议：
1.用 terrific broth (TB)而不是普通LB摇菌；
2.用 carbenicillin，不要用Ampicillin (如果你的细菌是amp抗性的话）；
3.如果还不行，可以尝试room temperature 摇菌两到三天。
我的问题换了TB就解决了，祝你好运！ |
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l***y
发帖数: 638 | 41 church的这个质粒克隆很麻烦，还不如直接gBlock合成
其实你可以去搞一个zhang feng的质粒把gRNA casette弄出来随便找个质粒一插，然后
用他的protocol克隆 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 42 我要制备某个细菌的基因组DNA，染色体有几个Mb，但是有个质粒小到几Kb。如果用常
规的密度梯度离心来分离纯化DNA，那这个小质粒恐怕会跟环境中的DNA碎片混在一起，
造成结果的污染。我们需要的是很纯净的基因组DNA，而且最好各组分的比例也是天然
的，所以最好一次性把染色体跟质粒同时提取。各位有什么好办法吗？多谢了！ |
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n********e
发帖数: 50 | 43 这个addgene的质量控制非常差，从它那里买10个质粒有1-2个work就不错了，尤其是
library的质粒。先前买了这个Human GeCKO v2 Library (1 Plasmid System), 无论是
PCR，挑单克隆测序，或是按照文献去酶切，都不能准确得到sgRNA。而且，addgene的
客服很差，总是推脱不是他们的问题，而是我们这里的检验手段不对，真是笑话。前后
花了750刀，就算打水漂了。提醒大家买这家的质粒一定要小心了。 |
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n********e
发帖数: 50 | 44 是啊，addgene就是有这样的问题；有些质粒粗测序看似正确，但是就是不表达或表达
size不对。虽然号称是非营利，但只要把质粒卖出去，那些人的工作和收入有保障啊！！
建议重要的质粒还是自己构建，虽然花时间，但品质有保障！！ |
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n********e
发帖数: 50 | 45 我知道他们卖的不贵， 但他们成本也低，又不用自己做质粒，只是从别人那要来的，
当然不会很贵。
其实这才是生财之道，看起来很便宜又不用负责任。以前，要质粒都是免费的，现在这
个addgene却可以以此为生，这是狡猾又聪明。
我的point是：不要全信addgene所谓的测序，重要质粒还是自己构建或找专业公司合成
，虽然花时间且贵些，但值得信赖。 |
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v********a
发帖数: 646 | 46 两个问题请教：
1、30kb的大质粒，应该如何转染，才能达到最高的转染效率？
2、这个质粒携带的是mouse gene，但是cmv启动子来自于pEGFP-N1质粒，可以转染人细
胞株么？
谢谢！ |
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v********a
发帖数: 646 | 47 两个问题请教：
1、30kb的大质粒，应该如何转染，才能达到最高的转染效率？
2、这个质粒携带的是mouse gene，但是cmv启动子来自于pEGFP-N1质粒，可以转染人细
胞株么？
谢谢！ |
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s*****i
发帖数: 315 | 48 韩的质粒虽然不带tag，但是c端多出来几个氨基酸
我当时做实验时从头合成了NgAgo，并且有C端完全没有加入任何多余氨基酸残基的质粒
版本。按着韩的转染protocol，用survyor assay看不到阳性结果。
他用lipofectamine 2000 瞬时转染hela cell都能有很好的结果，实在太可疑了。
lipofectamine 2000 转hela基本上达不到很高的效率，能有20%不错了
Ago
Ago |
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发帖数: 1 | 49 你的意思是说你用了2种质粒：
1） C端没有任何加入多余的氨基酸残基；
2）用了他提供的质粒（多了几个氨基酸残基）？ |
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d*****r
发帖数: 2583 | 50 ☆─────────────────────────────────────☆
Genemo (猜猜) 于 (Wed Jan 7 17:20:41 2009) 提到:
用Qiagen miniprep kit抽质粒
质粒大小 11.4kb
最后几乎没有产物
不知道是没有挂到柱子上还是挂太紧洗不下来了
不过很奇怪
不知道大家有没有遇到过
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CAMS (computer aided manufacturing system) 于 (Wed Jan 7 17:24:36 2009) 提到:
kit里面的各种溶液按照要求配好了吗？
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ppri (小地主) 于 (Wed Jan 7 17:29:26 2009) 提到:
恩，洗柱那一步的酒精加了吗?
11.4kb 大小是肯定没问题。
☆─────────────────────────────────────☆
iNGOR (葛大爷| 少灌水，多学习 |
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