s******s
发帖数: 13035 | 1 一个DNA sample, 前面处理比较强 99C啥的，估计有部分或者全部变成ssDNA了
请教两个问题
1. 有什么精确标准的办法确认是不是ssDNA，还是大多数仍然dsDNA
2. 接下来要deep-seq. 我知道可以重新加热慢慢降温重新anneal，或者用
hex nucleotide做prime做一轮PCR，恢复成dsDNA. 请问哪一个方法好一点？
如果后者，应该用什么polymerase, 或者有现成protocol么？ |
|
s******s
发帖数: 13035 | 2 谢谢。我想看一下我的DNA里面有多少是ssDNA
另外，什么常用酶只消化ssDNA, 而不是dsDNA (我知道S1, 不过听说量大的时候也
cut两把dsDNA). |
|
v*******n
发帖数: 499 | 3 有个问题想请教有经验的大牛
我用biotin pull down enrich 了一些 ssDNA, 想convert成dsDNA， 然后sequence.
有比较成熟一点的方法吗？
好像很多RNA->cDNA->dsDNA的kit我都不能直接用，因为说first strand synthesis 的
时候，那些kit加了一些特殊的adaptor, 然后在second strand synthesis 的时候就很
方便了。但是我ssDNA是直接从linear PCR 来的。不知道有没有什么好方法做second
strand synthesis。
谢谢 |
|
T**********t
发帖数: 1604 | 4 1. 可以跑胶看size吧，DNA ladder是双链的。看你的sample跑得位置和ladder是否一
致。不过如果你的DNA片段太小可能不容易判断。
2. 我觉得重新anneal就好了吧，除非你的ssDNA本身有复杂的二级结构，否则加热退火
之后anneal成dsDNA应该问题不大。重做PCR感觉很多此一举似的。不过我也没有做过类
似的sample处理，不知道实际做起来会不会是影响很大。 |
|
E*********s
发帖数: 93 | 5 我用oligo synthsize 2nd strand. 但是合成后如何才能区别dsDNA 和ssDNA？ 最好是
哪个gel staining reagent 可以直接通过跑gel 就可以知道。谢谢。 |
|
g*****s
发帖数: 1016 | 6 各位朋友，
小弟最近需要将ssdna immobilize到beads上 要求是这些dna在高温下不脱落 求方法！
用过几个月straptavidin-biotin 总会看到少量的脱落 不理想 |
|
a*****n
发帖数: 2835 | 7 需要共转pX260和ssDNA做knockin，感觉转染效率很低，很难筛到KI克隆
有没有好用的转染试剂推荐？ |
|
发帖数: 1 | 8 我看了半天没有找到，这些人做课题水平真不咋的。这么重要的对照组不做，或者是故
意隐瞒，有这个对照组就表明磷酸化ssDNA oligo knockdown mRNA是NgAgo
independent的 |
|
发帖数: 1 | 9 磷酸化的ssDNA oligo是不是能够被其他的argonaute招募去降解特异mRNA呢？ 如果能
，有个屁的意义啊 |
|
发帖数: 1 | 10 Hi all,
Does anyone have some exciting result using NgAgo. I have transfected the
293 cells with NgAgo and phosphorylated ssDNA targeted two genes, however,
there is no Indels at all. Even I did multiple transfections of ssDNA, no
positive result.
- 隐藏引用文字 -
On Tuesday, June 21, 2016 at 1:39:46 PM UTC-7, Aidan wrote:
Hi all,
I am trying out the NgAgo system in hard to transfect cells in which the
CRISPR-Cas9 system never produced any edits. I'm hoping for a non-coding
large deletion mediated by ... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 11 我来说说ngAgo的局限：
1.ngAGO是否真如文章所述，不和ssRNA结合。我觉得需要通过通过高通量测序进行验证
，电泳胶的灵敏度太低，看不到不代表没有。
2.ngAgo是否和内源ssDNA或ssRNA结合，如果它的结构和TtAgo类似（包含PIWI，PDZ以
及MID domain），那么这些保守的domain也存在于与ngAgo同源的argonautes（Ago2）
中，需要利用灵敏度比较高的手段才能说明这个问题，保不齐ngAgo会对PIWI或RNAi通
路有影响，5‘p-ssDNA以及5’p-ssRNA在细胞中存在，尤其是在germ cell的分化过程
中以及很多种类的癌细胞中，如果ngAgo和它们结合的话，这将大大限制其在此类细胞
中的应用。
3. ssDNA loading 的问题，目前对于ssDNA load到Argonaute形成DNP的机制尚不清楚
，在细胞内ssDNA load到Argonaute是不是需要其他蛋白质（比如伴侣蛋白，热激蛋白
等）的辅助，甚至Argonaute折叠成functional protein是否需要ssDNA的帮助，这些都
不是很清楚。
... 阅读全帖 |
|
h****n
发帖数: 2552 | 12 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: midwestPstD (中西部博士后), 信区: Biology
标 题: 请教CRISPR行家-HDR Template Design
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 18 16:24:10 2014, 美东)
看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里... 阅读全帖 |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 13 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
ssDNA在真核细胞内不如dsDNA的plasmid稳定... 阅读全帖 |
|
n**********g
发帖数: 196 | 14 1) Do you understand statistics?
2) you need to address why they conflict with each other. (Fig 4a and 4e).
You need to read others’ question first.
The denature process and buffer ionic strength of DNA sample will cause DNA
band migrates at an unexpected rate or at un-even shapes. Do you understand
why DNA
migrates under a certain pH and electrical filed. DNA migration, diffusion
and dispersion are three factors governing the final electrophoresis result
(DNA migration profile)
3) you need ... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 15 You leave me no choice but . I can not stand someone without any chemistry
sense when he/she is a biologist.
Chemical reaction is a on/off equilibrium. Some enzymes pick up the first
substance first and then the second one if the space arrangement is allowed
in the active site; some enzymes bind to a coordinated substance complex if
the reaction needs both substances available at the same time to fit into
the active site. It depends on the nature of individual enzymes. Since ssDNA
can not bind t... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 16
The denature process and buffer ionic strength of DNA sample will cause DNA
band migrates at an unexpected rate or at un-even shapes. Do you understand
why DNA
migrates under a certain pH and electrical filed. DNA migration, diffusion
and dispersion are three factors governing the final electrophoresis result
(DNA migration profile)
This is a whole academic issue and how it is running right now. If the rule
changes, I guess the quality of scientific research will be improved.
However, who is go... 阅读全帖 |
|
n**********g
发帖数: 196 | 17 1) The current low (zero) verified success rate is sufficient for people to
question the story.
When will your statistic data collection be completed? Let's talk about the
success
rate then.
Your comments are so interesting. If you do not know the science, just be
patient and wait for more answers.
2) “Do you think 1.3 mm difference (resolution)
can be achieved on peaks with a width of 1.5-2 mm?” The answer is yes
because of Fig 4e. Your statement is “difference
sample preparation” is completely... 阅读全帖 |
|
n**********g
发帖数: 196 | 18 OK, you want basic chemistry and here is basic chemistry.
“Since ssDNA
can not bind to the editing enzyme alone in vitro, the conclusion will be
the enzyme needs the second substance that is a conformation-ready genomic
DNA to form a functional enzyme-ssDNA-genomic target DNA complex to complete
the reaction. ”
----This is so wrong. There could be 100 reasons why an enzyme does not bind
a substance. For example, temperature, pH. Most importantly, it directly
contradicts Han’s data (Fig 1,2).
“As... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 19 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
|
c********n
发帖数: 225 | 20 更新后的Note部分：
（NBT 原文里没有）
Note:
1.NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of intracellular
bacteria (including mycoplasma) which are widespread and leave no visible
signs of presence. Carefully excluding the presence of intracellular
bacteria before performing experiments.
编者注：不能有细菌污染
2.Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
编者注... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 21 When will your statistic data collection be completed? Let's talk about the
success
rate then.
Your comments are so interesting. If you do not know the science, just be
patient and wait for more answers.
{1) Do you understand statistics?}
-----------------------------------
Ok, alright. I spent some time to explain it to you.
Fig 4a, the band distance from 1000 to 250 is 2.5 cm on my monitor. Based on
linear regression of Log(size) and migration distance, 30 nt will give out
1.3 mm difference ar... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 22 Before I start, I’d like to make my point crystal-clear. This will be
serving as my
last post on this subject and I am not interested in any college-level
discussion.
How soon do you want to close your statistical data collection? I guess
this time window of reproducibility will be determined by the journal and
the whole scientific community. Dr. Han’s fate does not concern me from
the beginning. However, I do care the quality of arguments against Dr. Han’
s
paper written up by some green-hand... 阅读全帖 |
|
s***e
发帖数: 911 | 23 1. 这个重组过程, 一定是在B-form dsDNA和RecA-ssDNA之间完成的吗?
2. RecA也可以直接和dsDNA作用, 形成dsDNA-RecA triplex. 这个结构在重组过程中有
任何作用吗? 比如, 重组可以不可以在dsDNA-RecA 和一个空的ssDNA之间发生?
3. 重组可不可以在dsDNA-RecA和ssDNA-RecA之间发生?
谢谢. |
|
x****6
发帖数: 4339 | 24 您高看我了，我自己是搞进化和微生物的，和这两个领域都不沾边，只是好奇，喜欢琢
磨新技术，所以多看了几片文献而已。
1. 关于细胞内源性ssDNA导致的off target hits。您可能没仔细读原文，这个蛋白只
会识别5'磷酸化了的ssDNA。他们原文里讲：“ we found a very limited number of
intracellular 5′-phosphorylated ssDNAs in mammalian cells. ”
如果这句话没错，那么就不会有off target hits。
2.关于iPS得奖。我并不是觉得它不deserve，只是觉得它有点早，而且跟gordon他们
nuclear transfer的工作一起拿奖有点不合适。现在也有很多工作发现iPS和真正的
stem cell并不是完全一样的。然后最近还有新的突破，如清华邓宏魁他们发现的用化
合物刺激就能诱导分化之类的发现分化、发育机制的工作，我觉得应该和iPS归为一类
的工作。先发给nuclear transfer更合适。等这边发育（分子）机制了解得再多一些，再
发给iPS和它的小伙伴们也不迟。这... 阅读全帖 |
|
m****a
发帖数: 270 | 25 连韩春雨的论文都没看懂在这儿瞎逼逼，还 enzyme-ssDNA，there is always an on/
off equilibrium.
麻烦你去看看论文原文和supplemental figure 1
NgAgo is faithful to its original guide and does not allow DNA swapping at
37 °C (Fig. 2d), similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound
oligos with free oligos at 37 °C. This feature of NgAgo minimizes the
possibility that it will be loaded with unexpected ‘guides’.
。。。。NgAgo follows a ‘one-guide-faithful’ rule, that is, a guide can
only be loaded when NgAgo protein is in the ... 阅读全帖 |
|
c********n
发帖数: 225 | 26 实验流程第二步：
2. Transfection
更新前
2-1 NLS-NgAgo expressing plasmid is extracted with Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega), and is adjusted to 100 ng/μl
in 0.5x TE buffer (5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.0).
2-2 5’-phosphorylated ssDNA guides are dissolved to 100 ng/μl in 0.5x TE
buffer (PH 8.0). For each well of a 24-well plate, 200-250 ng NLS-NgAgo
plasmid and 100-300 ng guidesare diluted in 50 μl Opti-MEM (Gibco); 1.25 μ
l lipofectamine 2000 is diluted in 50 μl Opti-MEM.... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 27 仇子龙的声称：
目前总结下我自己实验室对NgAgo的实验结果。
1，NBT Fig3c实验，对共转染的质粒表达的GFP蛋白确实可以看到显著的抑制表达作用
，但是DNA水平的切割并未看到，这个实验里面因为被切割的质粒有可能被降解，检测
不到突变也不能说明对DNA没作用，当然也不能排除，也许，NgAgo并非作用在DNA水平
对基因表达进行了抑制等可能性。
2, 基因组水平的实验重复，
a. 我们用NBT文章中的一模一样的ssDNA与薛天老师带回来的NLS-NgAgo进行实验，在
293细胞中无法重复NBT文章中的dyrk1a等基因的切割与Indel等等。没有在Hela细胞中
进行实验。
b. 我们自己设计了针对人源的kras, p53等基因的ssDNA，分别在293细胞中human kras
, p53基因上看到过测序水平的indel，且是ssDNA靶点区域的deletion，但是频率不高
，低于5%，同批比较的cas9切割效率20%。
c， 我们自己实验室还在重复，优化各种条件，比如筛选等等。
3，这是我们自己实验室的结果，其他的老师的结果我没有发言权，不评论
4，我呼吁一下，目前这些实... 阅读全帖 |
|
w********2
发帖数: 632 | 28 NgAgo is a single-stranded DNA (ssDNA)-guided Argonaute endonuclease, an
acronym for Natronobacterium gregoryi Argonaute. NgAgo binds 5′
phosphorylated ssDNA of ~24 nucleotides (gDNA) to guide it to its target
site and will make DNA double-strand breaks at the gDNA site. Like the
CRISPR/Cas system, NgAgo was reported to be suitable for genome editing,[1]
but this has not been replicated. In contrast to Cas9, the NgAgo–gDNA
system does not require a protospacer adjacent motif (PAM).
这个好像更容易应用些？ |
|
s******s
发帖数: 13035 | 29 I can tell u what I have done in China
Synthesis 10 ssDNA of 60Nts each (indeed, should be 5 dsDNA with
anealing end), ligate 6 together to get Mixture1, ligate the other
4 to get Mixture2, ligate Mixture1, Mixture2 with vector and finally
got the right product. It means to ligate 10 ssDNA (5 ds fragment)
with vector in one step, and it works!!!! |
|
发帖数: 1 | 30 Genome-editing
下午4:50（6 分钟前）
其他收件人： h********[email protected], c******[email protected], o*****[email protected]
将帖子翻译为中文
- 显示引用文字 -
hello guys,
we tried NgAgo plasmid cotransfection with 5'phospho-ssDNA guides and I must
say cell mortality rates are very high (toxic). We got 5'phospo-ssDNA
guides synthesised from IDT, desalt purification. Does anybody have tested
desalted verus PAGE purified ssOligos and looked for cell viability.
cheers! |
|
发帖数: 1 | 31 我比较希望韩春雨是因为隐藏了某些东西而导致大家无法重复。但是这种可能性很小，
实话实说，自从CRISPR-Cas9的出现就已经大大的降低了基因编辑的门槛，至少从基因
编辑的原理来说，不可能复杂到哪里去。基因编辑的过程就是给细胞提供分子剪刀和修
复模板，你的NgAgo通过载体运到细胞内部表达不可能比Cas9还要困难（如果你的文章
中用的NgAgo是你导入了某些突变的话，你并没有在文章中提及，而故意给大家发放错
误的质粒，我不知道这个大家该怎么看，至少作为一个人正常人都不会这么干的吧）。
另外5‘-P-ssDNA的运输进细胞也不可能会比90bp长的ssODN困难。唯一可以隐瞒的就是
如何降低5‘-P-ssDNA对细胞的毒性。不管怎么看，这篇文章都很weired。从他在北京
大学做报告来看，讲得确实很烂，不像是一个受过正规训练的科研工作者。 |
|
发帖数: 1 | 32 To be honest, the so-called evidence of data manipulation or fabrication in
Han's Paper
is so weak.
So far, two major pieces of evidence have been presented.
The first one is the shape and migration of DNA bands seem not to be similar
to those shown on protein SDS-PAGE. For these IDs, I will suggested a book
of DNA electrophoresis where you can read about some fundamental concepts or
knowledge. The following book are helpful to understand the DNA
electrophoresis data. (DNA Electrophoresis, Edite... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 33 To be honest, the so-called evidence of data manipulation or fabrication in
Han's Paper
is so weak.
So far, two major pieces of evidence have been presented.
The first one is the shape and migration of DNA bands seem not to be
similar
to those shown on protein SDS-PAGE. For these IDs, I will suggested a book
of DNA electrophoresis where you can read about some fundamental concepts
or
knowledge. The following book are helpful to understand the DNA
electrophoresis data. (DNA Electrophoresis, Edite... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 34 I was a nucleic acid research scientist, but not working on gene editing any
more
. The reason I am involved is to present some basic knowledge on nucleic
acid
research.
{1) I have no comments, but Dr. Chou has mentioned he was able to reproduce
it.
The biggest concern is not addressed by your answer. }
Band shift sometimes can be seen due to sample ionic strength and buffer.
{ 2) DNA band and migration are easily alternated by sample ionic strength
and
buffer.
No, I did not talk about band dist... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 35 理论讲解：
1、基因编辑技术及发展历史（ZFN，TALEN，CRISPR，NgAgo）
2、NgAgo基因组编辑系统
实验操作：
1、靶基因选择
2、ssDNA设计合成
理论讲解：
1、基因转染技术（脂质体转染，电转，病毒转导）
2、NgAgo系统转染策略
实验操作： ... 阅读全帖 |
|
|
c********n
发帖数: 225 | 37 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
项目 结题
date： 2017年8月2日
updated: 2017年8月4日
Note2017080401: added a few notable reviews/summaries
---------------------------------------
- NBT retraction note：
http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#correction2
原文引用
“Retracted online 02 August 2017
We are retracting our study because of the continued inability of the
research community to replicate the key results in Figure 4, using the
protocols provided in our paper. In this figure we report that the
Natro... 阅读全帖 |
|
m****a
发帖数: 270 | 38 其他部分大同小异，贴一下关键的note部分
Note:
1. NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of
intracellularbacteria (including mycoplasma) which are widespread
and leave no visible signs of presence. Carefully excluding the
presence of intracellular bacteria before performing experiments.
2. Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg 2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
3. Avoid using L... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 39 9月28日Joe Miano
Most of you have already moved on from this discussion but I wanted to chime
in one last time with our negative data in the mouse. Whether we used
original plasmid or a custom NgAgo that was codon-optimized for mouse with
untranslated sequences, a Kozak Methionine, and polyA tail the results were
uniformly negative. We used a 5' phosphorylated ssDNA (both IDT bought or
in vitro phosphorylated) along with the mRNA to codon-optimized NgAgo and an
HDR template we used successfully ... 阅读全帖 |
|
w***o
发帖数: 151 | 40 We can add a 5'-PO4-DNA (Single Stranded) to the 3'-end of a ssRNA using T4
RNA ligase I, but cannot add a 5'-PO4-RNA (single Stranded) to 3'-end of
ssDNA.
Highly appreciated any suggestion on how to add a ssRNA to a ssDNA. Thanks a
lot |
|
m****s
发帖数: 18160 | 41 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
|
m****s
发帖数: 18160 | 42 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
|
D**s
发帖数: 6361 | 43 来源：科学网丁广进博客、BioArt微信公众号
引言：《韩非子·喻老》一文中曾有言曰：“楚庄王莅政三年，无令发，无政为也。右
司马御座而与王隐曰：“有鸟止南方之阜，三年不翅，不飞不鸣，嘿然无声，此为何名
？”王曰：“三年不翅，将以长羽翼；不飞不鸣，将以观民则。虽无飞，飞必冲天；虽
无鸣，鸣必惊人。”
5月2日，Nature系列顶级刊物Nature Biotechnology在线发表了来自河北科技大学生物
科学与工程学院青年教师韩春雨副教授题为“DNA-guided genome editing using the
Natronobacterium gregoryi Argonaute”的重大原创性成果。文章甫一发表，瞬间刷
爆微信朋友圈，这里面有两层原因，其一，该项新的基因编辑手段对目前热火朝天的
CAS9技术提出了挑战；其二，领导该项研究的青年老师所在的单位和个人基本上籍籍无
名（抱歉，请允许我用了这个词）。
“不鸣则已，一鸣惊人”韩春雨老师在Nature？Biotech上发表诺奖级原创成果
Nature Biotechnology文章截图
小编先引用河北科技大学生物科学与工程学院官... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 44 Email on ngAgo sent to the ISTT mailing list：
Dear colleagues,
the publication by Gao et al in May in Nature Biotechnology http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27136078 triggered an enormous expectation. This Chinese team led by Chunyu Huan reported that the Argonaute (Ago) protein from a rare haloarchaea, Natronobacterium gregoryi, (NgAgo) would efficiently work for gene editing purposes in human cells. Ago had been described as an DNA-guided endonucleases two years before, through a Dutch-Span... 阅读全帖 |
|
a****r
发帖数: 12375 | 45 韩春雨研究团队声明
发文时间：2017-08-03
自2016年5月2日国际期刊《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）发表《NgAgo-
gDNA为导向的基因编辑技术》论文以来，多家实验室发表论文提出，采用该论文中提供
的实验方法与流程（protocol），不能重复其关键结果（Figure4），且至今尚无第二
篇表明NgAgo-gDNA可以有效进行基因编辑的论文发表，韩春雨及其论文共同作者决定主
动将该论文撤回，同时，将进一步研究不能重复其关键结果的原因，以期提供更详实有
效的实验方法与流程。关键实验条件标准化后的实验方法与流程将会尽快发布。
韩春雨团队一直在进行深入的实验研究工作。在近期的实验中已经发现，将ssDNA
guide 成功导入细胞以结合NgAgo是NgAgo进行有效基因编辑的关键。在满足一些关键条
件的情况下，NgAgo-gDNA系统可以进行有效的基因编辑。
下一步，韩春雨团队将按照学校的安排做好相关工作，选择一家第三方实验室，在同行
专家支持下开展实验，验证NgAgo-gDNA基因编辑的有效性，并将实验结果公布，回应社
会关切。
对论文发表以... 阅读全帖 |
|
H********g
发帖数: 43926 | 46 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: DrShepherd (Dr Shepherd), 信区: Biology
标 题: 韩副主席的NgAgo生物样品已收入Biosample
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Aug 6 10:35:43 2016, 美东)
Sample name: ssDNA NgAgo-induced DYRK1A
Submission： Hebei University of Science and Technology, Feng Gao; 2016-03-
11
《捉NgAgo》
池塘裡水滿了 雨也停了
老千的实验室里到處是NgAgo
天天我等著你 等著你捉NgAgo
韩副主席好不好 咱們去捉NgAgo
我们的韩副主席帶著你捉NgAgo
韩副主席好不好 咱們去捉NgAgo |
|
c******n
发帖数: 16666 | 47 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mitbbs (未名空间), 信区: Biology
标 题: Mitbbs水平挺高的，纯从科学家角度质疑韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 21 23:40:17 2017, 美东)
2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的... 阅读全帖 |
|
h****6
发帖数: 229 | 48 If you are only comparing PCR product,one possibility is salt carryover that
slowed down DNA. If you dilute the DNA, it may run normally. I know that if
too much DNA (or RNA) is loaded, the sample will run slower.
Illumina adaptor has phosphothioate modification but after PCR it is gone.
Another possibility is that DNA actually becomes ssDNA because of over
amplification. |
|
h****6
发帖数: 229 | 49 If it is high AT DNA, DNA may melt during gel running. If DNA melts, I
doubt it will re-form dsDNA under the same condition. ssDNA migrate slower. |
|
a***e
发帖数: 1010 | 50 make fresh buffer and run the gel again.
make sure the loading buffer is correct.
generally, ssDNA runs faster than dsDNA with the same length. So should run
below, not above, your expected band. |
|
