R****g
发帖数: 110 | 1 我在做illumina测序的样品，胶上切下来后再Qiagen column纯化的250bp的条带用
Bioanalyzer检测就成了350－
400bp了，不知道相信胶还是Bioanalyzer了。版上有没有朋友碰到过同样的问题，怎么
解决的？能直接送去测序吗？多
谢。 |
m******f
发帖数: 4352 | 2 prtein or dna?
【在 R****g 的大作中提到】
: 我在做illumina测序的样品，胶上切下来后再Qiagen column纯化的250bp的条带用
: Bioanalyzer检测就成了350－
: 400bp了，不知道相信胶还是Bioanalyzer了。版上有没有朋友碰到过同样的问题，怎么
: 解决的？能直接送去测序吗？多
: 谢。
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t****p
发帖数: 1504 | 3 bioanalyzer更可靠一些吧。有的facility在收到样品后会自己重新用bioanalyzer确证
一下。
350-400也可用，只要大小比较均一就好。我到facility看过，不同实验室的DNA大小差
挺大的。我猜DNA大了，只是在bridge扩增的时候会跟其它样品不太同步，产率低一些
，然后读出来的信号总体上弱一点；但是如果均一，把信号整体调高估计就可以。
【在 R****g 的大作中提到】
: 我在做illumina测序的样品，胶上切下来后再Qiagen column纯化的250bp的条带用
: Bioanalyzer检测就成了350－
: 400bp了，不知道相信胶还是Bioanalyzer了。版上有没有朋友碰到过同样的问题，怎么
: 解决的？能直接送去测序吗？多
: 谢。
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R****g
发帖数: 110 | 4 谢谢回复。我把跑胶的DNA ladder用Bioanalyzer检测了，条带大小是一致的，但是
illumina样品就多了100bp，我想
PCR的时候是不是产生了各种二级结构。
【在 t****p 的大作中提到】
: bioanalyzer更可靠一些吧。有的facility在收到样品后会自己重新用bioanalyzer确证
: 一下。
: 350-400也可用，只要大小比较均一就好。我到facility看过，不同实验室的DNA大小差
: 挺大的。我猜DNA大了，只是在bridge扩增的时候会跟其它样品不太同步，产率低一些
: ，然后读出来的信号总体上弱一点；但是如果均一，把信号整体调高估计就可以。
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m*p
发帖数: 226 | 5 I did not have this problem, either way, the size of the DNA fragment is
about 225bp. But, I almost made a
mistake, when I cut the gel, I barely can see the 100bp band, so I cut the
size of 300bp. When I cut the
second sample, I found I made a mistake, so I went back to cut the 200pb
size for both samples.
【在 R****g 的大作中提到】
: 谢谢回复。我把跑胶的DNA ladder用Bioanalyzer检测了，条带大小是一致的，但是
: illumina样品就多了100bp，我想
: PCR的时候是不是产生了各种二级结构。
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m*p
发帖数: 226 | 6 If the size of the knockout and control are different, then that might
affect the results.
【在 t****p 的大作中提到】
: bioanalyzer更可靠一些吧。有的facility在收到样品后会自己重新用bioanalyzer确证
: 一下。
: 350-400也可用，只要大小比较均一就好。我到facility看过，不同实验室的DNA大小差
: 挺大的。我猜DNA大了，只是在bridge扩增的时候会跟其它样品不太同步，产率低一些
: ，然后读出来的信号总体上弱一点；但是如果均一，把信号整体调高估计就可以。
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R****g
发帖数: 110 | 7 你用的PCR引物是illumina的吗？还是别的公司合成的？
【在 m*p 的大作中提到】
: I did not have this problem, either way, the size of the DNA fragment is
: about 225bp. But, I almost made a
: mistake, when I cut the gel, I barely can see the 100bp band, so I cut the
: size of 300bp. When I cut the
: second sample, I found I made a mistake, so I went back to cut the 200pb
: size for both samples.
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t****p
发帖数: 1504 | 8 你该不会说是加adptor前后差别100bp吧？
【在 R****g 的大作中提到】
: 谢谢回复。我把跑胶的DNA ladder用Bioanalyzer检测了，条带大小是一致的，但是
: illumina样品就多了100bp，我想
: PCR的时候是不是产生了各种二级结构。
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c*********r
发帖数: 1312 | 9 个人经验，Maker如果上样过多的话或跑的比较快，仔细观察你会发现每个条带的两边
有一小部分跑得慢一些，那个可能才是实际的大小。另外，跑胶之后你可以切多个不同
大小的片段制备测序的library，多做一个也不很费时，有备无患。 |
R****g
发帖数: 110 | 10 不是，我是原来DNA打碎后加的Adaptor的，然后用PE引物做了emulsion PCR，PCR产物
250bp切胶回收后又用PE引物
重新扩增。总之，用PE引物扩增的产物用E-gel和bioanalyzer检测的大小差100bp左右
。我现在想想可能是引物的问题，
原来illumina的引物我用完后就用invitrogen合成的，不知道illumina是不是把引物做
了修饰所以特别好用，或者和我自己
的引物序列都不一样。
【在 t****p 的大作中提到】
: 你该不会说是加adptor前后差别100bp吧？
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R****g
发帖数: 110 | 11 谢谢回复。我把E-gel的DNA ladder在Bioanalyzer上跑过，条带是一致的。所以E-gel
和Bioanalyzer两个都没问题。我
原帖没写清楚。我把PCR产物直接纯化后用E-gel和bioanalyzer检测，还是差100bp左右
，还有我用普通的PCR产物（不
是illumina 样品）做正对照，E-gel和bioanalyzer结果两者是一致的，所以这事和胶
就没关系了。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 个人经验，Maker如果上样过多的话或跑的比较快，仔细观察你会发现每个条带的两边
: 有一小部分跑得慢一些，那个可能才是实际的大小。另外，跑胶之后你可以切多个不同
: 大小的片段制备测序的library，多做一个也不很费时，有备无患。
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m*p
发帖数: 226 | 12 Yes, I used the primer from illumina. I agree with you the primer will
affect your size.
【在 R****g 的大作中提到】
: 你用的PCR引物是illumina的吗？还是别的公司合成的？
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m*p
发帖数: 226 | 13 You are doing Chip Sequencing?
【在 R****g 的大作中提到】
: 我在做illumina测序的样品，胶上切下来后再Qiagen column纯化的250bp的条带用
: Bioanalyzer检测就成了350－
: 400bp了，不知道相信胶还是Bioanalyzer了。版上有没有朋友碰到过同样的问题，怎么
: 解决的？能直接送去测序吗？多
: 谢。
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R****g
发帖数: 110 | 14 不是。
【在 m*p 的大作中提到】
: You are doing Chip Sequencing?
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R****g
发帖数: 110 | 15 谢谢回复。真是郁闷，百思不得其解，原来想想是小菜实验啊。
【在 m*p 的大作中提到】
: Yes, I used the primer from illumina. I agree with you the primer will
: affect your size.
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h****6
发帖数: 229 | 16 If you are only comparing PCR product,one possibility is salt carryover that
slowed down DNA. If you dilute the DNA, it may run normally. I know that if
too much DNA (or RNA) is loaded, the sample will run slower.
Illumina adaptor has phosphothioate modification but after PCR it is gone.
Another possibility is that DNA actually becomes ssDNA because of over
amplification. |
