|
|---|
|
|
|
|
|
|
P****R
发帖数: 22479 | 1 我来说说ngAgo的局限：
1.ngAGO是否真如文章所述，不和ssRNA结合。我觉得需要通过通过高通量测序进行验证
，电泳胶的灵敏度太低，看不到不代表没有。
2.ngAgo是否和内源ssDNA或ssRNA结合，如果它的结构和TtAgo类似（包含PIWI，PDZ以
及MID domain），那么这些保守的domain也存在于与ngAgo同源的argonautes（Ago2）
中，需要利用灵敏度比较高的手段才能说明这个问题，保不齐ngAgo会对PIWI或RNAi通
路有影响，5‘p-ssDNA以及5’p-ssRNA在细胞中存在，尤其是在germ cell的分化过程
中以及很多种类的癌细胞中，如果ngAgo和它们结合的话，这将大大限制其在此类细胞
中的应用。
3. ssDNA loading 的问题，目前对于ssDNA load到Argonaute形成DNP的机制尚不清楚
，在细胞内ssDNA load到Argonaute是不是需要其他蛋白质（比如伴侣蛋白，热激蛋白
等）的辅助，甚至Argonaute折叠成functional protein是否需要ssDNA的帮助，这些都
不是很清楚。
4.specificity的问题，文章中说NgAgo的特异性要优于spCas9，但是文章中的数据不足
以支持这一点。spcas9中可以容忍5bp的mismatch，这个数据是来源于whole-genome
deep sequencing的data。不能用gel indel的数据和deep sequencing的数据进行比较
吧。即便如此，从NgArgo的文章中给出的结果也可以，one-base-pair的mismatch仍然
可以看到大量的indel，即使在P8位置的mismatch仍然可以看到indel。如果利用全基因
组的off-target analysis （比如 GUIDE-seq，BLESS或者体外的Digenomic-
sequencing），设计相同的target，对NgAgo和spCas9进行side by side的分析，然后
做对比，这样才会得出可信的结论。另外，可以容忍5bp mismatch的cas9是spCas9，对
于其他的cas9比如NmCas9，SaCas9以及Cpf1几个实验室都没有看到off-targets （off-
targets很大程度是依赖于你设计的target sequence的specificity）。
5.ssDNA integration的问题。目前尚不知5‘p-ssDNA是否会通过基因组上的DSB随机整
合到基因组中，5‘p-dsDNA会以较高的效率通过DSB整合到基因组中，如果5‘p-ssDNA
也是如此，那么这将将会对NgAgo的应用造成不小的困难。
正如博文中所说的那样，这是一个创新性极强，应用前景尚不明朗的工作，想取代
CRISPR/Cas9，还要解决很多unknowns，毕竟spCAS9有这么多兄弟，作用机制研究的相
对清楚，并且很多lab已经做了很多optimization，已经开始应用在gene therapy中了。
另外，这个技术在国内有点被过度解读（诸如打脸fengzhang，doudna，要获得诺奖
blabla）了，很多人（行业内外的）关注的不是技术本身，而是作者本人或单位，把它
看做是打脸学霸学阀的一个工具。这也侧面说明国内的科研经费分配的问题。
国外也在关注这个技术，但是更多的是技术本身，并且已经有实验室在repeat NBT的实
验了，期待后续的进展。 |
|
|
|
|
|
|
