m****M
发帖数: 360 | 1 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
b**********8
发帖数: 349 | 2 我觉得是可行的，screening的时候最好把这个基因的shRNA plasmid和带flag标签的该
基因的表达质粒共转，3,4天后收蛋白做WB，用anti flag的抗体去检测，效果更明显。 |
C*****h
发帖数: 926 | 3 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为
【在 m****M 的大作中提到】
: 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
: 涉及到的问题
: １。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
: ２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
: 本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
: 谢谢。
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b**********8
发帖数: 349 | 4
），
学习了，不过这个方法的原理是什么？目的基因序列扮演了luciferase的3‘UTR角色？
【在 C*****h 的大作中提到】
: 可以的。
: 最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
: stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
: 然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
: （最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
: 我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
: 两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
:
: shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
: 化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
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z**********8
发帖数: 766 | 5 可行，但是不是knockdown效率最好，功能影响就最大 |
m****M
发帖数: 360 | 6 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
b**********8
发帖数: 349 | 7 我觉得是可行的，screening的时候最好把这个基因的shRNA plasmid和带flag标签的该
基因的表达质粒共转，3,4天后收蛋白做WB，用anti flag的抗体去检测，效果更明显。 |
C*****h
发帖数: 926 | 8 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为
【在 m****M 的大作中提到】
: 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
: 涉及到的问题
: １。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
: ２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
: 本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
: 谢谢。
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b**********8
发帖数: 349 | 9
），
学习了，不过这个方法的原理是什么？目的基因序列扮演了luciferase的3‘UTR角色？
【在 C*****h 的大作中提到】
: 可以的。
: 最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
: stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
: 然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
: （最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
: 我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
: 两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
:
: shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
: 化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
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z**********8
发帖数: 766 | 10 可行，但是不是knockdown效率最好，功能影响就最大 |
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m****M
发帖数: 360 | 11 Haven't been here for a long time!
Thank you so much evevery one for your great input. |
M*****n
发帖数: 16729 | 12 great project.
it will be a nature paper. |
z*y
发帖数: 84 | 13 Could you please explain the principle? Why is luciferase affected by
unrelated shRNA?
Thanks.
），
【在 C*****h 的大作中提到】
: 可以的。
: 最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
: stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
: 然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
: （最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
: 我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
: 两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
:
: shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
: 化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
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h******y
发帖数: 55 | 14 用sicheck2 plasmid来筛shRNA。
包子 |
l********s
发帖数: 70 | 15 我需要说一下， 当然是adenovrius 高啊， 但是 adenovrius 不是稳定表达的，是瞬
时表达的。 lentivirus 是稳定表达的插入染色体 |
