p******i
发帖数: 1092 | 1 查你用的載體/系統的MANUAL，裡面應該寫了
我以前用過一個什麼shRna的KIT，裡面要求加P；載體是KIT提供的，我忘記了是不是2個不同的酶切位點
引物5'带磷酸基需要另外加錢
而且de-salt quality的primer貌似還不能加P，需要高純度的primer，還要加錢
你問的那個人難道是要給LAB省錢？ |
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D******9
发帖数: 2665 | 2 想在LEUKEMIA的细胞系中用lentiviral shRNA KNOCKDOWN一个基因， 打算用puromycin筛
选，跟贴壁细胞一样做么？ 死细胞怎么除去呀？ 每次加新药都要先离心吗？谢谢 |
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s*******g
发帖数: 121 | 3 try transfection kit from Amaxa or shRNA in lentivirus.
20nM |
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a******n
发帖数: 392 | 4 如果要在细胞系里同时knockdown两个基因，怎么选择RNAi的方法阿？siRNA,
lentiviral shRNA? 效率哪种高？ |
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a******n
发帖数: 392 | 5 多谢。如果用lentiviral shRNA，infection 之后几天可以用puromycin测定
transduction的效率？ 在加puromycin之
前，需要把细胞重新plate吗？ |
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j*********o
发帖数: 237 | 6 最近在做一课题，在两种人的肿瘤细胞系中瞬转siRNA knock down了某个基因，结果第
二天就发现细胞大量死亡，到第三天细胞基本死光光，同时做的non-targeting siRNA
control细胞生长正常，初步确认是这个基因的下调导致了细胞死亡。
但问题是，细胞死的太快了，试了好几个浓度，要么太低了没有RNAi效果，高了细胞就
翘了，导致无法具体分析细胞死亡的原因和后面的分子机制。
想过tet-on诱导性RNAi，但目前公司卖的tet系统基本都是用cmv promoter,似乎不能指
导shRNA的转录，但是可以知道microRNA转录，不知能否设计针对该基因的microRNA来
做诱导性的knock down? 至于如何设计不太了解，
没方向了，想请教一下在这方面有经验的同志，任何建议都欢迎！！
多谢先！ |
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T**********r
发帖数: 287 | 7 I bought the bacterial stock from Thermo Scientific Open Biosystems
Expression Arrest GIPZ Lentiviral shRNAmir. How can I check whether the
shRNA is a validated one from the sigma website? Thanks a lot!
validated SH |
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S*******m
发帖数: 34 | 8 我买过sigma和open biosystem的 shRNAs。 Sigma 的从来没有失败过， 而open
biosystem有可能不work。 我建议你从简单的步骤开始查起，先酶切看看你得到的克隆
对不对。省时间省力气。如果你拿到的是菌株，多挑几个克隆试试。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 9 你有过用SABiosciences ShRNA的经验吗?谢谢! |
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a*****g
发帖数: 543 | 10 search their website.
MISSION ShRNA. If it's pre-validated, they will state that so it's a selling
point. |
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f****b
发帖数: 314 | 11 不合理。shRNA 需要RNA h1 or R6 promoter. |
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a****d
发帖数: 1919 | 12 楼上正解，你需要dual promoter vector. CMV drives mCherry and H1 drives shRNA
expression separately |
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T**********r
发帖数: 287 | 13
多谢回复，这个正是我考虑的一点，但我这样设计的依据有两个：
1.CMV promoter可以drive shRNAmir的表达，见图1,干扰效果，CMV与H1和U6效果一样
。文章为
2005年nature genetics的Second-generation shRNA libraries covering the mouse
and human genomes.
2.Openbiosystem shRNAmir的设计采用相似的策略。CMV/tuboGFP/IRES/puro
R/shRNAmir,也是一个CMV promoter驱动两个蛋白和一个shRNAmir同时表达。见图2。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 19 SAbiosciences有现成的.
IDT 的SciTool 可以设计.并可跟sales联系,他们可以帮忙.甚至可以上门演示如何设计. |
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d****u
发帖数: 1553 | 23 我有一点点转不过弯来。当进行shRNA 的genome wide screen的时候，最后要提取基因
组DNA然后PCR扩增hairpin
sequence为下一步无论是array还是sequencing做准备。这一步PCR怎么能保证扩增出来
的产物还在线性范围内呢，还是
有什么特殊的算法。有没有同学做过，给个提示啊。谢谢了先。 |
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d****u
发帖数: 1553 | 24 策略大概是这样的，首先假定这是一个negative selection， 筛选marker是细胞的生
长速度。我们用一个pooled shRNA library（好比说有100K hairpins）去转染或感染
细胞。那么经过一段时间的细胞分裂之后（让我们假定一个月），有些hairpin会使细
胞增长加速，有些hairpin会延缓细胞生长。从表象上看就是在整个细胞群体中，有些
hairpin被富集了，有些被降低了。这时候就可以收细胞提DNA，然后PCR扩增hairpin
sequence。然后或者上array或者上nextgen sequencing。两者的read out都是hairpin
在整体中的丰度。然后再normalize to 第一天的data。就能算出哪些hairpin可以促进
或抑制细胞生长了。我的问题就是这时候做PCR如何保证整体里不同的hairpin是线性扩
增使得最后的read out能够进行比较。我的理解是这时候不管是array或sequencing都
不能让你知道在整个population里那个基因被knockdown了。而是告诉你你的这个DNA中
有哪些ha... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 25 我记得Scott W. Lowe有片筛选肝癌里tumor suppressor的cell就是这么干的，
不过没仔细看，不记得他的文章里有没有说这个问题。
但我觉得PCR效率应该影响不大，primer都是一样的，扩增的又都是shRNA的序列，而且
又很短。
现在的ChIP-Seq也都是加了adaptor扩增后去测序，似乎也没有考虑PCR效率的。
hairpin |
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o**4
发帖数: 35028 | 26 我也不确定那个比较有效果，所以我想同时加进去，会不会效果更好点?
同一个细胞会不会同时感染三个不同的lentivirus？
谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 28 O(∩_∩)O谢谢，
也就是说会有叠加效应是吧？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 29 u would have to prove individually first before pool them...or you would
have to design ways to control for the off target effects... |
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v***a
发帖数: 1242 | 30 弱弱地问一下，一般大家都用什么方法来说明有没有off target effects？ |
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w***a
发帖数: 4361 | 32 换几种不同的siRNA against同一个target，
然后看phenotype是否一致？
其实任何siRNA或多或少都有off target effect，特别是siRNA浓度大的时候。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 34 不确定就分开三个试试好了，混一起有几个问题：
1. 增加了off target的机会。
2. 发paper的时候，如果是critical experiment还是需要证明单独的siRNA起效。
3. 混一起，如果virus的效率很高也就罢了。如果效率比较差，那么会有很多cell只感
染一个，两个的。你最后的phenotype就会比较moderate，以后的实验就比较麻烦。
这个跟pool的siRNA transfection一样。如果只是一个比如说pilot experiment，其实
倒是无所谓，混着就混着用好了。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 35 其实都是同一个基因的设计的3哥不同的lentivirus啊，
如果哪个基因有表型，我再分开分析就可以了吧？ |
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s**********r
发帖数: 1120 | 36 难道不是细胞被一个病毒感染后会“关闭”自己，其他病毒不容易再感染了吗？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 37 我以前也听说过这个，但是事实证明细胞能被反复感染的。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 38 为啥混在一起会增加off target？我以前听说的是（我只做过siRNA）混在一起反而降
低了off target effect。 |
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n****y
发帖数: 819 | 39 哪位知道有什么公司卖siRNA/shRNA targeting human beta-actin? 最好是target 5'
3'UTR的。多谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 40 我有一个很傻的问题啊，在我仔细看那个文章之前，我想知道他们是怎么做那么大规模
的RNAi screening 的？莫非他们有一个很大的shRNA library? |
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p*****m
发帖数: 7030 | 41 帮老婆问的 请牛人们指点呀
实验是这样的，lp要在BMDC里knock down几个gene，她做了lentivirus/retrovirus里
面带目的基因的shRNAmir，然后她取了小鼠的bone marrow,用病毒侵染，然后加入
GMCSF诱导分化成DC。如果是retrovirus的话是侵染fresh bone marrow （spin
infection）；lentivirus的话是BM分化4-5天后加病毒进去
现在的问题是，不管是哪种virus（包括没有shRNA的control），侵染后看得到GFP+的
细胞证明侵染成功，但是看不到CD11c+的细胞了（如果不加病毒的话，CD11c+分化正常
），调整MOI没有用处。
牛人们帮忙看看这个有什么可能解释 然后有什么解决方法么？看起来似乎病毒本身就
能抑制BMDC分化 可是病毒侵染DC也算是常用方法了 不知道哪里出了问题。。 |
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p****l
发帖数: 291 | 42 别叫俺前辈，haha
我没做过病毒载体感染DCs，但是做BMDCs非常多
实验室有人用病毒载体转染HSC，各个阶段前体细胞，还有pDC的
我能想到的建议就是
首先设置严格对照
1.bone marrow cells cultured with GMCSF for 4 to 5 days, facs CD11c vs.
MHCII
2.bone marrow cells transduced with empty retrovirus at day0, facs CD11c vs.
MHCII at day4 to 5, and plus GFP signal in facs
3.same as 2, but retrovirus carrying shRNA
4.before transduction with lentivirus, check CD11c vs. MHCII
5.letivirus also empty virus control and experimental vector
我觉得问题在病毒本身的可能性更大，我不知道她用什么载体
理论上，如果对照组CD11c表达... 阅读全帖 |
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l*****m
发帖数: 122 | 43 谢谢你的建议:)
具体说说我的virus载体和transduction的过程吧~
1> retrovirus用的是MSCV based带有mir155 backbone的一个载体（某postdoc自己构
建的）有GFP marker。因为它只侵染dividing cell, 所以就在collect BM的当天做一
次spin infection （用fresh virus containing sup from transfected 293T cells)
，之后两天各做一次spin infection，然后让细胞在有GMCSF的medium里面继续分化到
day7 (中间换一次medium). 最后收细胞染色FACS. 现在结果就是no virus control分
化没什么问题，通常我得到90％ CD11c+细胞，其中MHCII+大概15％；问题是无论是
control virus (empty vector)还是有target shRNA的virus，细胞就不表达CD11c了 (
<10%），MHCII到没怎么变，还看过CD86之类的co-stimulatory molecul... 阅读全帖 |
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y***i
发帖数: 11639 | 44 如果这个技术的效率能提高到实用水平的话，比现在的药的优势是
1。一旦发现致病的信号通路，立刻可以找到相应的shRNA，而现在的针对蛋白质的分子
药物只能大量筛选实验。
2。基本上所有的可以抑制的蛋白质都是酶，分子抑制剂通过结合于活性位点来抑制。
所以大部分蛋白质是没有特异性分子抑制剂的。一个pathway可能有几十个蛋白，但只
有几个可能找到特异性的分子药物。但对RNAi来说没这个问题。
RNAi看上去还是比gene therapy强，当然，你说得对，两者面临的delivery的问题一
样，而且目前看不到出路。 |
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d*p
发帖数: 534 | 45 siRNA，合成的，不能做pool screeing，所以全基因组的必须要有机械臂。
shRNA，在病毒载体上，可pool screeing. 全基因组的，可分成多个pool，你收到的是
plasmid mixture。普通实验室都可以做，只要你能拿到这个library. |
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j********r
发帖数: 156 | 46 最近观察到一个现象，百思不解，各位帮忙分析一下。
某癌细胞中, 稳转 tet-on shRNA vector targeting gene x (which is a
potential oncogene). 加Dox 3-4天，发现细胞明显停止生长，死细胞增多 (also
there
is induction of PARP cleavage). Akt phosphorylation does not change.
However, these seems obviously increased phosphorylation on ERK1/2 and
ribosomal protein S6. Can't figure how cell death occurs in the
presence of mTORC1 (hyper-) activation.大家说说有哪些可能的survival
pathways, 多谢！ |
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l**********n
发帖数: 240 | 47 how about your cells with control-shRNA?
I suppose you have one as control. |
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j********r
发帖数: 156 | 48 Thanks for the replies. I do have the scramble control, and there is no
difference between minus dox and plus dox. Also another shRNA (which does
not knockdown the target gene expression pretty much based on rt and western
data) doesn't show dox-induced cell death.
This gene product seems highly transforming. I am wondering how cell death
occurs in the presence of increased phosphorylation of those growth/
transformation-correlated factors, like s6 and Erk. (though it is possible
they might co-e... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 49 我们系有很多人往老鼠胚胎的脑子里搞电转shRNA质粒
听他们的seminar效果还不错。 |
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p****z
发帖数: 31 | 50 是啊，这就是我百思不得其解的地方。一开始用promega的MTS assay，怕因为要算细胞
数目导致误差，后来就采用BrdU proliferation assay,结果还是相差不大。当时买的
shRNA sets里面有5个clone,选了一个效果最好的。郁闷啊！ |
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