c***3
发帖数: 251 | 1 这个我感兴趣，我做siRNA efficacy predition的。
当然从某种角度来说也算是灌水文章，毕竟计算也就是一个概率游戏，不可能得到100%
肯定的结果。
有兴趣可以聊聊 |
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h***e
发帖数: 20195 | 2 non viral siRNA delivery体系不少, in vitro silencing efficacy 到95%以上的也
有一些，上临床的也有1－2个，好像没成功
主要现在最大的问题是liver accumulation和毒性
function |
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g****y
发帖数: 101 | 3 谢谢，我当然有兴趣了，能不能告诉我siRNA efficacy predition是怎么做的吗？ 通
过Blast? 我看有一些文献为了筛选specific的SiRNA, 设计好几个不同的SiRNA去处理
细胞, 然后做Microarray去看这些SiRNA的调控的基因，通过对比来看特异性，不过我
觉得这个好像也不是很可靠，毕竟Microarray里表达量下降的基因很多，我们也不知道
哪些基因是直接由SiRNA抑制的
100% |
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g****y
发帖数: 101 | 4 liver accumulation 可能是因为liver有清除外来异物的功能吧， 我打算用的病毒也
是在liver有很高的感染效率，所以我打算突变掉病毒capsid的肝脏识别序列并替换成T
cell ligand， 希望这样能提高感染T细胞的效率， 不知道这种设想可不可行， 赫赫 |
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h***e
发帖数: 20195 | 5 病毒这块我不懂，非病毒的体系没有这么简单，很多GENE DELIVERY的体系体外确实很
好，就是卡在liver 这步
成T |
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g****y
发帖数: 101 | 6 hehe, 这么说治疗肝癌还是比较可行的了，无论病毒还是非病毒，deliver到肝脏都是
小事一桩阿 |
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h***e
发帖数: 20195 | 7 ANYWAY，现在CANCER THERAPY的最新方向不是SIRNA了，发好文章没问题，拿FUNDING问
题多多
function |
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g****y
发帖数: 101 | 9 现在CANCER THERAPY的最新方向是什么？ Immunotherapy? 赫赫，感觉SiRNA都还没有
成为过CANCER THERAPY的重要方向就已经被淘汰了？如果能发好文章也行啊， 有好文
章才有可能拿funding阿，呵呵，题外话了 |
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d*p
发帖数: 534 | 10 siRNA 还是一个不错的方向，毒性和specific delivery是药界的共同的问题，也是
siRNA目前最大障碍了，不过对肝脏疾病我觉得还是很有用的。 |
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s*******t
发帖数: 7746 | 11 SiRNA is NOT specific.
use Morpholinos oligos (made by Gene Tools,LLC, http://www.gene-tools.com/). It is antisense oligo with high specificity, stable in the cells (can not degraded by RNAase or DNAase or Proteinase etc). I have used Morpholinos in cell culture and mouse. Work really well. |
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C*****h
发帖数: 926 | 12 Antisense oligos are not specific either. |
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s*******t
发帖数: 7746 | 13 Not completely true. A well designed antisense oligo along with proper
controls, antisense oligo can be specific. |
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b**********8
发帖数: 349 | 16 最近用sigma的PLKO.1-puro制备一个基因的shRNA慢病毒颗粒。于是想到这样一个问题
，到底什么样的质粒可以用来包装慢病毒呢？比如像pCDNA3.1这样的质粒，能不能包装
慢病毒从而提高转染效率呢？
可能有点白，但是还是很想知道权威的解释。多谢各位 |
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b**********8
发帖数: 349 | 17
），
学习了，不过这个方法的原理是什么？目的基因序列扮演了luciferase的3‘UTR角色？ |
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z**********8
发帖数: 766 | 18 可行，但是不是knockdown效率最好，功能影响就最大 |
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b**********8
发帖数: 349 | 19
），
学习了，不过这个方法的原理是什么？目的基因序列扮演了luciferase的3‘UTR角色？ |
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z**********8
发帖数: 766 | 20 可行，但是不是knockdown效率最好，功能影响就最大 |
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m****M
发帖数: 360 | 21 Haven't been here for a long time!
Thank you so much evevery one for your great input. |
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M*****n
发帖数: 16729 | 22 great project.
it will be a nature paper. |
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l********s
发帖数: 70 | 23 我需要说一下， 当然是adenovrius 高啊， 但是 adenovrius 不是稳定表达的，是瞬
时表达的。 lentivirus 是稳定表达的插入染色体 |
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b**********8
发帖数: 349 | 24 最近要做一个inducible shRNA 的stable transfection，采用的细胞株之前已经做过
一遍稳转，G418 resistance。现在改用Hygromycin B筛选新的稳转株，已经挑了将近
100个克隆了，一个阳性的都没有挑到，很郁闷。想问下有经验的战友们，已经做过一
轮稳转的细胞株，再做新的稳转，是不是难度特别大？什么原因呢？难道是我人品太差
？ |
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t****0
发帖数: 439 | 25 提高病毒浓度。
也许你转的shRNA是lethal的？ |
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c****g
发帖数: 93 | 26 赞楼上的说法！其实再弄几对shRNA看看如何，脱靶真致命！ |
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t****g
发帖数: 120 | 27 今天做shRNA lentivirus 的感染实验，在serum free medium里incubate了6个小时，
拿出来准备加含FBS的medium的时候不小心在hood里洒了含有病毒的medium.
两个问题：
1。安全。 我尽量用含bleach的喷液清洁了hood里洒了medium的地方，但还是害怕没清
干净。万一有残留在手套上的，然后再污染到hood外面别的地方，会有危险吗？
2。实验。 按照protocol细胞应该在有病毒的medium里培养48小时，然后开始
selection. 可我的这些细胞只incubate了6个小时，是不是会影响transduction
efficiency很多啊?
真够倒霉的！ |
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C***Y
发帖数: 61 | 28 I am trying to generate cell line with inducible knockdown. I used Tet-pLKO
-puro, in which a puromycin resistant gene is placed downstream of pGK-TetR-
IRES. The problem I am having now is that the expression level of puromycin
resistant gene was so low that all the cells were killed by puromycin. I
heard that the single vector Tet-induicible system selling by Clontech is
not very good either. Have anyone found any system satisfactory?
Thanks. |
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b**********8
发帖数: 349 | 29 Why did you say the single vector Tet-induicible system selling by Clontech
is not very good? In contrast, I read many papers in which the authors used
the syetem to devolope inducible kd stable cell line and conduct in vivo&
vitro study. Below are some of them,
1)THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 29, pp. 20383–20396,
July 18, 2008
2)J Clin Invest. 2010;120(12):4289–4302. doi:10.1172/JCI42015. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 31 为什么要钙转？效率低。
换mirus Transit LT1。
openbiosystem 有protocol |
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b**********8
发帖数: 349 | 32 谢谢楼上，终于等到回复了
鉴于我帖子中描述的这个protocol已经是我师姐建立的很成熟的方法，不过在我这里遇
到了一些问题，所以我更期待针对这些问题的意见和建议，目前暂不考虑更换protocol
，谢谢啦 |
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d*p
发帖数: 534 | 33 然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。
48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上，看起来阳性，实际不是。 |
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m******g
发帖数: 69 | 35 这个帖子对于一个即将要读生物PHD的人是个很大的打击。 我个人感觉随便找个人，在
实验室教他一个月，怎么cell culture, 怎们做western。只要有钱买抗体，就能做
cell signal的活。我现在觉得cell signal就是一个大大的坑！一看公司送来的signal
poster，他妈的全都有联系。从A一只能联系到Z，随便找个信号分子，做做induction
,看看pathway的key enzyme的变化，就可以下结论说，哦，这个分子影响这个pathway
，然后做做细胞功能assay，得出结论这个分子有神马功能。然后发现这个分子是蛋白
大家族的一员，有开始做其他成员的pathway，或者又发现个上游或者下游的调节因子
，然后又开始做这个因子的pathway，最后做做in vivo，KO mice，会玩的还会看看这
个分子在免疫细胞的作用。
然后做做siRNA,shRNA,FISH,IHC 说是这个东西是潜在的biomarker，又说mAb,si/sh-
RNA可能成为治疗某种疾病的手段。
我感觉太胡掰了，简直是自己给自己讲故事。天天MAPK.NF-KB,AP1,GP... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 36
多谢回复，两个抗体都是购自于Upstate公司，他们公司卖这两个抗体已经很久了。WB
出来的size大小也都一致。所以我觉得抗体应该没问题。
另外，mRNA水平确实有非常明显的降低，infection shRNA lentivirus之后72小时就能
看到大约80%的降低。
欢迎更多的讨论。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 37 的确，靶基因有两个isoforms，不过我们设计的shRNA 对两个isoforms都能target。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 38 如题，以我的实验为例，需要制备针对某个基因的shRNA lentivirus，这个基因对细胞
的生长和增值很重要，刚好293FT里也有这个基因的表达。我的问题是，293FT培养基中
的virus会不会干扰293FT中该基因的表达？ |
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o**i
发帖数: 1165 | 39 293 cells stop proliferating upon plasmid transfection.
the effect of shRNA of any kinds should be minimal. |
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j******1
发帖数: 1315 | 40 才知道和Third Generation的package system不match，大家有什么办法吗？谢谢回复 |
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j******1
发帖数: 1315 | 43 谢谢dsamyu的回复，您用过pTripz了吗？如果可以的话，它们网站上说的其实是pTripz
(和2nd match)和3rd不match.太狡猾了。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 45 check Ihor Lemischka's paper. |
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s******a
发帖数: 472 | 46 Knockdown of the gene confers survival disadvantage? |
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t****g
发帖数: 120 | 47 谢谢回复！
我开始也以为是影响survival，还挺高兴，以为发现了这个gene的一个作用，可在
knockdown的细胞里，也没发现有increased apoptosis。
原来这是个common issue吗？ 我做knockdown的细胞的一个主要目的是收RNA做
microarray，好看看这个gene影响到哪些genes/pathway。 为严谨起见，我从不同的
passage收RNA，而不是一个passage好几个盘子。 可因为这种loss of knockdown最后
我都收的RNA都不能用了。
如果用inducible knockdown的话，用多长的time window为好呢？ 3天？ 一个星期？
还是各有利弊只能做做看？ |
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j******1
发帖数: 1315 | 48 理论上应该挑单克隆的细胞 3-4个，鉴定后再mix在一起。当然，大家都是能用就好了
，很少有人真这么做。 |
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C***Y
发帖数: 61 | 49 I usually add puromycin to cells 36 hrs after transduction,
and harvest cells for RNA 72 hrs after adding puromycin. You should be able
to get enough cells for microarray this way. Actually, I am testing inducible systems now,
and the problem I having now is leakage.
？ |
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B******o
发帖数: 496 | 50 你的目的是什么呢？什么细胞呢？如果只是收RNA做array，完全不需要筛stable line
啊。直接做virus infection就好。pLKO无论是virus的生产量还是KD的效率都很高的
1
effect
the |
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