d*p
发帖数: 534 | 1 Do you have a empty vector as control? I don't like puromycin. All of my
shRNAs were cloned into plko.3G. GFP will tell you the infection rate. And
you may sort the GFP positive cells. |
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S****r
发帖数: 982 | 2 I think the sequence of shRNA you were using differs from reported siRNA,
and it's often that some sequences of sh/siRNA affect on cell proliferation,
presumbly targeting other proteins. |
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c**b
发帖数: 2999 | 3 【 以下文字转载自 Medicine 讨论区 】
发信人: syltool (基因治疗), 信区: Medicine
标 题: 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jan 8 19:23:34 2011, 美东)
梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
与大家讨论。
现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每天只需花半个多小时，好处多多，何乐而不为... 阅读全帖 |
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b******k
发帖数: 1874 | 4 这是Oct干的吧？呵呵
开玩笑。我听说short RNA 在特定条件下可以稳定靶基因的，比如stress，和Oct也有
关。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 5 真是奇了怪了，有相关文献么？
O(∩_∩)O谢谢 |
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b******k
发帖数: 1874 | 7 不过，更有可能只是RNA定量等技术的误差所引起。 |
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L**********O
发帖数: 1761 | 8 what is the empty vector you used? |
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o**4
发帖数: 35028 | 9 我同时做了很多个knockdown，同时用realtime检测，
只有这个有问题， 技术上应该没有问题 |
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a********k
发帖数: 2273 | 16 关键是只想用一个荧光marker，这样FACS才有足够的光谱给二抗。
原代细胞就养几天，没法筛又。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 17 恩，找了一圈，发现很多人cotransfection几个，很多人做tandem，也有很多人用几个
cassette表达的。
vector |
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e*****y
发帖数: 146 | 18 确定knock down后细胞死掉是这个gene的功能，而不是你RNAi中用到的试剂的毒性？ |
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t**a
发帖数: 255 | 20 knock down 后多久才死？一般infection 2-3 天后用qRT-PCR检测target gene表达量
，如果那时候细胞还活着的话。 |
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V*f
发帖数: 171 | 21 siRNA transfection only gives transient knockdown (3-7 days). If the
phenotype takes longer than 3-7 days to show, then siRNA hardly works.
Also some cell types are not easy to transfect.
Dharmacon and Ambion are good companies for siRNAs. |
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i*********t
发帖数: 78 | 22 For lentivirus, I use MOI 1:3 to get no more than one copy in a single cell
for my genomic shRNA library screening. |
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w****u
发帖数: 1078 | 23 最近试了几次，使用spin的方法，效果都不好，效率特别低（5%左右）。请问谁有
working protocol.多谢。 |
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d*p
发帖数: 534 | 24 同学，咱们做的课题怎么相似啊，等我把文章发了再告诉你，嗬嗬！ |
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w****u
发帖数: 1078 | 25 protocol最好提前share一下，因为内容不相关，不会涉及到你的成果的。 |
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y*********r
发帖数: 78 | 26 I had the same problem before with murine primary T cells. Probably
retrovirus is better. |
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z******e
发帖数: 3 | 27 对retrovirus转human oncogene一直有疑虑，怕不安全。 |
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w****u
发帖数: 1078 | 29 CD4+ T cells.Any new idea? |
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d*p
发帖数: 534 | 30 我这方法在CD8上还行。 在CD4上面没效果，你试试retronectin吧。 |
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b******e
发帖数: 3348 | 31 问题可能有些弱智，老板要求转染某个基因的siRNA到一个动物细胞，以前我没做过
siRNA transfection,只用lipofectamine 2000转染过某基因的overexpress vector到
动物细胞，网上查了一下，dharmacon有这个基因的siRNA,是不是买了那个smartpool,
然后用lipofectamine 2000就可以转染了（当然成功与否，到不到50%得实验做了才知
道）,那个smartpool是四个RNAs的pool对吧，不知道这个过程是不是正确的。
菜鸟一个，敬请指教，非常感谢。如果有protocl能够让小弟看看那就更好了
包子答谢。
PS，不需要长期stock,所以暂时不考虑shRNA. |
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F*******2
发帖数: 103 | 32 不管你们做siRNA, 还是shRNA, 不做rescue control吗？如果脱靶的话，你再
introduce wt A基因的话，B下调的phenotype是不能回复的 |
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o**4
发帖数: 35028 | 33 建议做rescue，看看B的表达在shRNA之后能不能恢复 |
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b**********8
发帖数: 349 | 34 多谢楼上各位的建议，rescue的实验我们确实还没做过。今天又想向大家反应点新情况
，如下：
当初shRNA敲除A的时候，B基因在mRNA和protein水平都有显著下调。如前文所述，包括
B基因启动子的报告基因实验，组蛋白乙酰化和甲基化修饰，DNA甲基化等都是阴性结果
。后来实在没办法了，和别的组里的人讨论了下，觉得是否有可能A通过维持B基因转录
产物的稳定性，于是我又做了这个实验，转染A基因的siRNA后，等待48小时，再向
medium中加入Actinomycin D,每隔4小时收集细胞提取RNA,分别收集0,4,8,12小时，每
次3个wells，然后做realtime RT-PCR，结果在两个细胞株中发现siRNA组细胞中B基因
mRNA降解的比siCONTROL更快，但是在另外两个细胞株里没有观察到这种分别。现在又
出现几个问题：
1）观察到分别得那两个细胞株里，48小时候（即加药的第0小时），A基因的knockdown
效率只有50%。而在另外两个没有分别的细胞株里，48小时的沉默效率却有80%，老板觉
得即使mRNA降解实验阳性，很有可能是artifact，认为我的数据... 阅读全帖 |
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y******u
发帖数: 246 | 35 我是学工程+bioengineering，只是随便分析分析：
现在知道的是：
shRNA A knockdown = B 表达水平下降
siRNA A knockdown 100% = B 没影响
siRNA A knockdown 80% = B 没影响
siRNA A knockdown 50% = B 降解加速
如果rescue无法排除脱靶的话，
你试一试siRNA A knockdown 30%和10%，看看吧。。。 |
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h*****4
发帖数: 1158 | 36 没rescue出来之前不要做太多阿，这是最基本的control阿，
谁知道那么大量的shRNA会引起啥变化
难道你师姐前一篇快接受的文章没有这个rescue试验？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 37 发信人: hffmsb4 (Hong), 信区: Biology
标 题: Re: 大家有没有经历过这种情况？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Mar 5 02:33:15 2011, 美东)
没rescue出来之前不要做太多阿，这是最基本的control阿，
谁知道那么大量的shRNA会引起啥变化
难道你师姐前一篇快接受的文章没有这个rescue试验？
多谢你的建议，我们确实还没有做过这个rescue的实验。但是我现在最想知道的是，影
响mRNA stability的因素当中，除了3’UTR，还有那些因素，分别可以用什么实验方法
来验证，请各位献言献策吧。多谢了 |
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b*****l
发帖数: 9499 | 38 正如大家说的，重点肯定还是 rescue 了，而且也不难做，有这折腾的时间说不定早就
做出来了。
不过我好奇哈：shRNA 是你师姐做的，但是你重复过没有？
另外，老板说 artifacts 不是说怀疑你 modify data。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 39 design two shRNA, could you get the same phenotype? |
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p*****m
发帖数: 7030 | 40 没rescue的话是不是至少得有个scrambled RNAi或者multiple targeting construct一
起用才行？ 其实按lz这个说法 如果真是off target，当时多用几个shRNA的话应该就
能看出来吧
。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 42 个人觉得评价个人的时候，还要考虑到方向问题
比如A发表文章的IF 和 该领域内文章的平均IF相比如何
不是每个人都做最热门的东西，
前两年miRNA,siRNA, shRNA热门的时候，相关文章发高IF的几率大很多
相比较 Physiology想发个》10的就比较难
是数 |
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f****s
发帖数: 133 | 43 我觉得还是留在牛老板实验室好，钱，我是说科研经费和奖学金通常比较有保证
想我呆在AP的实验室，本来项目进展还比较顺利，结果现在老板的R01很可能renew不上
，现在买个shRNA都付担不起了，本来要用的细胞系也买不起了只能管认识的人要别人
也是爱答不理的，更不用提本来我proposal里写的动物模型了，提RNA以前是kit现在是
trizol，做qPCR以前用supermix现在都自己配还用中国产的taq误差很大有时做几次就
有几次完全不同的结果，几乎所有的buffer都是自己配的出问题都不知道怎么
troubleshooting哪个环节都可能会出错，现在枪头都是自己买大包自己装盒子里用，
养细胞的大flask还得涮涮重复使用，一周一半的时间在准备这些玩意儿，下个学期还
要去做TA能做实验的时间就更少了，CHIP我都是自己设计N多个引物看能不能碰运气扩
出来，旁边的实验室的哥们做类似的项目都用上CHIP-seq了，结果好省时间还学到新技
术，每次committee member见面问我进展我都不知道怎么说了
还犹豫啥呢，楼主？ |
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D******y
发帖数: 723 | 45 we use lenti-virus carrying shRNA
down |
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p********i
发帖数: 116 | 47 谢谢回复，promoter是H1或者U6在序列的设计上有差异吗？ |
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m*********n
发帖数: 56 | 48 都是Pol III promotor，但是H1比U6表达弱 |
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y*******i
发帖数: 96 | 49 一年前毕业于中部一个医学院, 在家呆了一年生娃,现在重出江湖找博士后,因为家庭原
因,只能在indiana州找,不知道是funding太紧了,还是我的实力问题,连面试都没有,我
贴了我会的技术如下,大家帮忙分析一下.
Cell culture, DNA, siRNA or shRNA transfection, Protein quantification,
Western blot, ELISA, Methods to detect cell proliferation, cell apoptosis,
cell migration and cell invasion, Immunofluorescence, Confocal microscopy,
Flow cytometry, Immunoprecipitation, RNA or DNA purification, RT-PCR,
Metabolic labeling of proteins, Luciferase assay, Two-dimensional
polyacrylamide gel electrophoresi... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 50 这个靠谱，呵呵
siRNA吧还是，简单，快速。如果不怕麻烦，想screen不同的cell lines就shRNA virus
好了。得到的cell lines将来还可以直接种老鼠上。 |
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