s******s
发帖数: 13035 | 1 应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统 |
|
a********a
发帖数: 428 | 2 有没有同学遇到shrna包装成lentivirus后，不能knock down targeted protein了、、
没有包装成lentivirus之前，kd效果还不错。。。 |
|
r***e
发帖数: 2539 | 3 作用不大，但是有可能enrich multiple copy integration。
一个细胞感染多个病毒。但是shRNA和puro表达量不一定线性。 |
|
S*********s
发帖数: 304 | 4 T2A
your-gene-T2A site-puro
在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
google
The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
sequences
inducible system
请参考
Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
, Stegmeier, F., Yao, Y.-M., and Lengauer, C. PTEN-deficient cancers depend
on PIK3CB, Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 13057-62, 2008
http://www.addgene.org/21915/
另外还有两载体系统
pCMV6-TetR
TO-shRNA
很多公司都有，google
你现在的stable ... 阅读全帖 |
|
e*******c
发帖数: 1479 | 5 最近用了invitrogene的pLKO-Tet-On诱导系统做shRNA， 用VsVg和Delta8.9做包装，
但就是不能产生病毒，或病毒低度基本测不到， 那位大虾用过此系统， 难道不能用
Vsvg包装体系而必须买他们自己的viralpower系统？
谢谢 |
|
F*K
发帖数: 608 | 6 Hi all,
I plan to rescue knockdown of a mouse gene with human cDNA.
However, the human gene only mismatches the 21nt shRNA on #2, 17 and 20
positions. I am wondering if it is ok for rescue?
thanks |
|
F*K
发帖数: 608 | 7 Yes, I want to know if 3 mismatch at those positions are enough to be
resistant to shRNA. the KD cell line is hard to transfect, so cannot test. |
|
s******y
发帖数: 28562 | 8 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
这个质粒的用法也描述得非常含糊。
我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！ |
|
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 10 谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
的序列？） |
|
x****u
发帖数: 530 | 11 我用的pRRL-U6-hPGK-GFP
效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
到。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 12 谢谢！我们的细胞，在我们所需要用的shRNA 成功表达之后也会死。
正是因为这个原因我们需要用荧光蛋白标记而不能用药选。
你用的那个质粒做克隆的时候方便么？那个什么pGIPZ克隆起来老麻烦了。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 13 关于 Tet-inducible shRNA，除了Open Biosystem 的，addgene 上有没有便宜的？
对了，能不能麻烦你多说两句那个design 3‘ mismatch 是什么意思？ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 14 所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
了 (不过居然这样也能发个Nature Method...) |
|
f******g
发帖数: 1003 | 15 用Bamhi会损坏mir30，影响shRNA的表达
另外，plko载体好像没有荧光，至少我们最开始用的那个open biosys没有 |
|
d*****i
发帖数: 3905 | 16 用lentivirus deliver shRNA， infect后puromycin select 2到3周，先做RT-PCR，显
示最高knockdown efficiency有70%，细胞冻了后解冻做WB，显示protein几乎没啥变化
。Antibody可以detect FLAG-tagged的protein，所以觉得antibody似乎问题不大。
大家都啥建议？？Thx |
|
s******y
发帖数: 28562 | 17 我的意思是在你把细胞冷冻然后又解冻的过程中，那个lentiviral based shRNA 失效
不表达了。所以有可能在你检测WB的时候mRNA level 已经上升到原来的水平了。建议
你把同一批细胞拿来同时测mRNA and protein level. |
|
s******y
发帖数: 28562 | 18 lentiviral shRNA vector 的promoter是可以被silence 的
我建议你先用RT-PCR 重新检查一次，先确定不是这些原因再说。 |
|
c*******7
发帖数: 314 | 19 ft，为啥要puro select两到三周阿？太长了，2天就可以。2-3周我整个试验都做完了
。建议重新做一次，用早期的细胞看knockdown，我一般select完了立刻做wb。我的细
胞一直keep在半量的puro里面，3个礼拜之后好几个shRNA的knockdown明显就减弱了，
从90%降到50%knockdown |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 20 puro selection no guarantee stable knockdown
puro只要一点点 就可以保证细胞活下来
但是，表达一点点，未必能有足够量 miRNA shRNA production |
|
|
|
m******t
发帖数: 109 | 23 sequence 和酶切点已知。OE 作过，shRNA 真没作过。 多谢 |
|
i*****i
发帖数: 154 | 24 Just order shRNA from Sigma.
5 clones for $300, much cheaper than order oligos from IDT. |
|
s*****l
发帖数: 263 | 25 这对我来说已经完全是piece of cake. 不过当初学 shRNA 克隆时 吃了很大的苦头。 |
|
s*****l
发帖数: 263 | 26 这对我来说已经完全是piece of cake. 不过当初学 shRNA 克隆时 吃了很大的苦头。 |
|
t**l
发帖数: 109 | 27 第一个问题是： 这个retroviral 系统会不会导致random integration?
如果有random integration,这个问题是不是已经被忽略了？
第二个问题是： 这个shRNA 是不是永久表达? drug selection gene 需不需要加，如
果有GFP在这个construct里面，能不能FACS出来GFP+ 细胞，是不是就不需要drug
selection gene.
第三个问题： 当初的viral transduction效率有多高？ 在ES细胞上如何。
最后一个问题是： 如果做screen, 这个barcode 当初在做library的时候是不是唯一的。 |
|
a*****s
发帖数: 131 | 28 请问哪个公司的shRNA做stable knockdown cell line比较靠谱？多谢！ |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 29 尽量挑Sigma自己列出来，效率高的shRNA.好像是要有自己的account才能看到这个数据
。不然你得找technical support要。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 30 我们本来是想做一个可诱导表达的蛋白载体，在同事们中问了一圈，只有一个人有一个
tetracyclin-inducible vector for shRNA (Tet-On pLKO) ,而且promoter 是H1。 我
想问的是，假如
我用这个来表达一个很小的蛋白（10kd)行不行？ |
|
b**********8
发帖数: 349 | 31 如题，人在国内，没有fedex账号（我知道考验我人品的时候到了），请问谁有MISSION
® TRC2 pLKO.5-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA(产品编号
SHC202)这个质粒？Sigma官网这个质粒要4000多，太贵了，哪位好心人愿意馈赠一点？
如果不方便走fedex（如果有收货方付款的话更好了），选择普通邮寄也可。非常感谢
！ |
|
b**********8
发帖数: 349 | 32 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
后重复好几回了，都是一样的结果，现在无奈把这一块交给公司做了，但是自己还是不
死心，今天写出来问问大家... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 33
用的是同样的shRNA 以及同样的靶细胞来knock down 同样的蛋白么？ |
|
b******1
发帖数: 93 | 34 我们一般一个基因买五个shRNA,基本上两个可用， 两个没效果， 还有一个是反的。个
人觉得最好还是拿别人发表的序列用，几率高点。 |
|
r******t
发帖数: 135 | 35 选择shRNA的序列，用哪一种软件比较可靠？多谢 |
|
a******s
发帖数: 37 | 36 有几个在pLKO载体上用的效果不错的shRNA打算移植到MSCV-miR30载体上，不知道会不
会一样有效？ |
|
E*********4
发帖数: 16 | 37 我把一个蛋白的基因插在本来是shRNA的位点（AgeI site），做了transient
overexpression，可以做puromycin筛选，检测到蛋白表达，但是做了virus之后，加
puromycin，细胞全死了，说明puromycin没有表达。这是为什么呢？BTW，在我的基因
前加或者不加promoter，会有什么影响吗？
这是Tet-pLKO-puro的链接：
https://www.addgene.org/21915/
非常感谢！ |
|
f*****f
发帖数: 195 | 38 看哪些shRNA/guide RNA被富集，deep sequencing depth一般不需要RNA-seq那么高吧
，一个样品一般价格多少？有公司测序链接么？ |
|
r******k
发帖数: 446 | 39 我的shRNA的plasmid上带了一个GFP （IRES system） 然后我facs out GFP。 那么问
题来了， facs的时候有的细胞GFP亮 有的没那么亮。 是不是facs GFP最亮的那个群体
最好？这种群体的KD efficiency最高？ |
|
m******t
发帖数: 109 | 40 ２个90%相似蛋白，想用一个１个SHRNA KD,请问哪家公司有这个服务 |
|
C*********h
发帖数: 83 | 41 有微友私信问设计siRNA、shRNA和gRNA. 今天先说siRNA和shRNA吧。
一般我是take advantage of sigma. 他们有现成的shRNA产品，而且反响很好。
当然了，土豪可以自己去Dharmacon订购siRNA， 或者在sigma订购shRNA,甚至是包装好
的病毒。
1.第一步去sigma英文网站，一定要是英文网站
http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html
#华夏小奇说实验的事#设计siRNA和shRNA
2. 搜索你感兴趣的基因。如TNFR, 出来结果之后点击shRNA(下图黑色剪头所示)
插播广告 订购基因敲除小鼠请访问公司网站（2-4个月，小鼠转基因、敲除敲入、条件
性敲除）
#华夏小奇说实验的事#设计siRNA和shRNA
3. 点击进入下个页面，点击pricing，会出现每个shRNA的hairpin的序列。
如下面的序列，介于“CCGG”和"CTCGAG"之间的，就是shRNA的目标序列。
可以根据这个序列设计siRNA和shRNA(自己合成hairpin, 退火连入pLKO or Te... 阅读全帖 |
|
M***D
发帖数: 249 | 42 Antipsychotics: A New Hope Against Glioblastoma
Researchers have discovered that FDA-approved antipsychotic drugs possess
tumor-killing activity against the most aggressive form of primary brain
cancer, glioblastoma.
The team of scientists from the University of California, San Diego School
of Medicine, led by principal investigator Clark C. Chen, MD, PhD, used a
technology platform called shRNA to test how each gene in the human genome
contributed to glioblastoma growth.
ShRNA stands for small ... 阅读全帖 |
|
d*p
发帖数: 534 | 43 这几年一直在做高通量的shRNA筛选，感觉现有的产品有很大缺陷，想开发以下产品：
现在做功能研究比较快,能够进行高通量的就是knockdown and over-expression 这两
种方法。因此想做下面两类产品：
1， 覆盖全基因组的shRNA和siRNA， 每个基因两条， 每条的knockdown效率经过验证
，保证大于80%，提供蛋白水平的knockdown结果。
2， 覆盖全基因组的cDNA表达库，克隆每个基因的cDNA到Lenti-vector, 带上Barcode。
算了一下成本，用我的方法，大概5m 美元能够做完人和小鼠的这两个库，Broad现在也
在做，但是他们的方法效率太低，结果还非常不可靠，按他们的方法，50m都不够。
完成以后,
1. 可卖单个基因的产品，和市场上的公司竞争，全球市场大概有5亿美元左右的市场。
目前市场上的shRNA基本都是卖几个给你，不知道那个有用，有时候一个有用的都没有
，或者knockdown太低，看不到表型，需要自己花时间去验证。
2. 全基因组的knockdown 和over-expression library完成后，每个基因有两... 阅读全帖 |
|
d*p
发帖数: 534 | 44 这几年一直在做高通量的shRNA筛选，感觉现有的产品有很大缺陷，想开发以下产品：
现在做功能研究比较快,能够进行高通量的就是knockdown and over-expression 这两
种方法。因此想做下面两类产品：
1， 覆盖全基因组的shRNA和siRNA， 每个基因两条， 每条的knockdown效率经过验证
，保证大于80%，提供蛋白水平的knockdown结果。
2， 覆盖全基因组的cDNA表达库，克隆每个基因的cDNA到Lenti-vector, 带上Barcode。
算了一下成本，用我的方法，大概5m 美元能够做完人和小鼠的这两个库，Broad现在也
在做，但是他们的方法效率太低，结果还非常不可靠，按他们的方法，50m都不够。
完成以后,
1. 可卖单个基因的产品，和市场上的公司竞争，全球市场大概有5亿美元左右的市场。
目前市场上的shRNA基本都是卖几个给你，不知道那个有用，有时候一个有用的都没有
，或者knockdown太低，看不到表型，需要自己花时间去验证。
2. 全基因组的knockdown 和over-expression library完成后，每个基因有两... 阅读全帖 |
|
r***e
发帖数: 2539 | 45 谢谢你的解释。
我本人对怎么构建library的技术问题不懂，比如你说单个shrna的丰度我也是第一次听
说，我原以为每个shRNA的copy数都是一样的呢。
我有一系统很好的小鼠模型，想上一些shrna screen。所以如果你能在我的载体上插入
高质量的shRNA library，我非常想和你合作。当然目前你可能还没有现成的library s
equence。
方便的话，可以站内信或者电话聊聊。
shrna, |
|
b**********8
发帖数: 349 | 46 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
实在没办法，把以前shRNA的序列发给Dharmacon公司，让他们合成siRNA,然后又能重复
到以前的现象。
我现在怀疑前面的A调节B的发现很可能是shRNA... 阅读全帖 |
|
a*****x
发帖数: 901 | 47 学界的标准是要能用slient mutant的cDNA rescue。而且比较严格必须要lentivirus
cDNA rescue, 因为cDNA plasmid copy 数过多会titrate out siRNA/shRNA.
作为screen两个validate好的shRNA是可以接受的。但我还是觉得validation不那么容
易。 而且现在大多都run pooled shRNA screen,然后再收细胞做deep sequencing。
一般的HTS还是用siRNA为主。
shrna |
|
C*****h
发帖数: 926 | 48 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: Carwash (for+free), 信区: Biology
标 题: 3T3 transfection效率太低
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Apr 28 21:47:39 2010, 美东)
用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
不知道是怎么回事？
0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
转染1x10^5细胞。
不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
看目标蛋白是不是减少了。
可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
总个western blot还剩下99％的蛋白质。
有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。 |
|
a*****y
发帖数: 269 | 49 Please send in cover letter and CV to Nathan Lee: n**********[email protected]
Postdoctoral Positions in Pfizer Oncology, La Jolla CA
The post doctoral positions will be responsible for elucidating the
mechanism of action of existing Pfizer
portfolio compounds, ensuring that we have the appropriate patient selection
strategies for such
mechanisms, aligning the research into patient selection with the
appropriate diagnostic assay,
understanding mechanisms by which patients fail (or become resistant to... 阅读全帖 |
|
|
