m******m
发帖数: 535 | 1 刚刚接触细胞生物学，没做过knockdown，这里问两个关于mammalian细胞knockdown的
初级问题，请大家不要笑话。
1） 准备在raw cell line 中 knockdown一个kinase，初步看看对下游cytokine的表达
有没有影响，看文献有人用Dharmacon的siRNA pool转化，有人用lentivirus shRNA，
请问哪种方法更简单？
2） 如果直接转化siRNA，等3－4天以后，细胞都分裂了好几代了，是不是每隔细胞内
的siRNA的量减少很多，这样是不是knockdown的效果就不好了？
3） 为什么siRNA可以直接转化knockdown基因表达，但是好像很少人直接转化shRNA去
knockdown的？为什么shRNA都要科隆在plasmid载体或者virus载体内呢？直接转化难道
不能被dicer酶加工变成siRNA吗？（因为从文献上查到了一个shRNA的序列，如果能直
接合成然后象siRNA那样转化，岂不是能剩了买siRNA的钱，又剩去了科隆shRNA到载体
的时间）。
比较初级的问题，请别笑话！
谢谢！ |
o**4
发帖数: 35028 | 2 siRNA是瞬时转染，只能维持几天，对于一般细胞来说，比shRNA lentivirus简单好用。
shRNA lentivirus主要是为了稳定转染，建立knockdown的细胞系，需要构建质粒、做
病毒，然后infection，麻烦些。 |
n******2
发帖数: 971 | 3 I have the exact same question as LZ asked. Why can't we just use shRNA to
do transient transfection to knock down a gene? Once the shRNA constructs
get into cells, small hairpin RNA will be transcripted, which will be
further chopped by Dicer into siRNA. Thereafter, shRNA shares the same
mechanism for knocking down certain gene as siRNA does. What's the reason
to make stable transgenic cell line? |
C*****h
发帖数: 926 | 4 1. ShRNA needs time (24-48 hours) to get maximum expression, while siRNA
can function immediately after transfection.
2. For a lot of cell lines, transfection efficiency of shRNA-plasmids
(large size) is low, while that of siRNAs is high because of the small size.
to
【在 n******2 的大作中提到】
: I have the exact same question as LZ asked. Why can't we just use shRNA to
: do transient transfection to knock down a gene? Once the shRNA constructs
: get into cells, small hairpin RNA will be transcripted, which will be
: further chopped by Dicer into siRNA. Thereafter, shRNA shares the same
: mechanism for knocking down certain gene as siRNA does. What's the reason
: to make stable transgenic cell line?
|
m*********7
发帖数: 5207 | 5 For question #3: the purpose of cloning shRNA into lentiviral vector is to
produce virus particles, and in principle, every single target cell can be
infected. If you use shRNA plasmid directly, you can hardly get 100%
transfection efficiency. |
Z**********g
发帖数: 222 | 6 1. 没有直接合成shRNA转染的吧.shRNA比siRNA长,又还需要dicer处理,又不能解决长时
间效力的问题,吃饱了撑着合成shRNA啊.
2. 所以shRNA都是转化成DNA的形式,然后克隆到载体上.用载体直接转染后,若不筛选稳
定克隆则仍然无法解决长时间效力的问题.当然病毒好一些. |
a****k
发帖数: 1130 | 7 transfection of shRNA will induce interferon response
【在 m******m 的大作中提到】
: 刚刚接触细胞生物学，没做过knockdown，这里问两个关于mammalian细胞knockdown的
: 初级问题，请大家不要笑话。
: 1） 准备在raw cell line 中 knockdown一个kinase，初步看看对下游cytokine的表达
: 有没有影响，看文献有人用Dharmacon的siRNA pool转化，有人用lentivirus shRNA，
: 请问哪种方法更简单？
: 2） 如果直接转化siRNA，等3－4天以后，细胞都分裂了好几代了，是不是每隔细胞内
: 的siRNA的量减少很多，这样是不是knockdown的效果就不好了？
: 3） 为什么siRNA可以直接转化knockdown基因表达，但是好像很少人直接转化shRNA去
: knockdown的？为什么shRNA都要科隆在plasmid载体或者virus载体内呢？直接转化难道
: 不能被dicer酶加工变成siRNA吗？（因为从文献上查到了一个shRNA的序列，如果能直
|
p********i
发帖数: 116 | 8 shRNA直接转到细胞里也会被转录有？应需要promoter吧。 |
d*******s
发帖数: 61 | 9 我只用过siRNA，目前做了一个shRNA载体，但还没有使用。直接转染shRNA质粒应该是
可行的。目前有很多载体，表达shRNA而且带有真核筛选抗性。虽然效率比病毒低，但
是只要你筛选一下，应该就能解决这个问题！ |
m******m
发帖数: 535 | 10 谢谢！
size.
【在 C*****h 的大作中提到】
: 1. ShRNA needs time (24-48 hours) to get maximum expression, while siRNA
: can function immediately after transfection.
: 2. For a lot of cell lines, transfection efficiency of shRNA-plasmids
: (large size) is low, while that of siRNAs is high because of the small size.
:
: to
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m******m
发帖数: 535 | 11 谢谢了！
不过为什么不能直接合成shRNA然后转染呢？
【在 m*********7 的大作中提到】
: For question #3: the purpose of cloning shRNA into lentiviral vector is to
: produce virus particles, and in principle, every single target cell can be
: infected. If you use shRNA plasmid directly, you can hardly get 100%
: transfection efficiency.
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m******m
发帖数: 535 | 12 谢谢！
不过如果文献上已经查到了好用的shRNA序列，为什么不能直接合成然后转染呢？siRNA
买个pool要好多美刀呢，可是缺很难查到有报道的好用的siRNA序列去合成转染。
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 1. 没有直接合成shRNA转染的吧.shRNA比siRNA长,又还需要dicer处理,又不能解决长时
: 间效力的问题,吃饱了撑着合成shRNA啊.
: 2. 所以shRNA都是转化成DNA的形式,然后克隆到载体上.用载体直接转染后,若不筛选稳
: 定克隆则仍然无法解决长时间效力的问题.当然病毒好一些.
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m******m
发帖数: 535 | 13 谢谢！
这个到还没有想到过，估计是这个原因吧。
能被RIGI或者MDA5识别？激活下游的interferon？是不是这样？
【在 a****k 的大作中提到】
: transfection of shRNA will induce interferon response
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Z**********g
发帖数: 222 | 14 你这个直接合成然后转染是什么意思吧.
是直接合成shRNA(非DNA)?这会比siRNA便宜吗,会比siRNA效率高吗,能延长时效吗?都不
能吧.
是直接合成shRNA的DNA?它能被转录吗,有干扰效率吗,能延长时效吗?都不能吧.
siRNA
【在 m******m 的大作中提到】
: 谢谢！
: 这个到还没有想到过，估计是这个原因吧。
: 能被RIGI或者MDA5识别？激活下游的interferon？是不是这样？
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