C********4
发帖数: 308 | 1 @新药研发观察
史上最苦B 的生物学家：Douglas Prasher 号称最先发现绿色荧光蛋白(GFP)，但是不
但没有得到诺贝尔奖，反而经历多次换实验室和下岗，最终离开科学领域，成了汽车司
机。最新进展：在61岁又回实验室做实验了。 http://t.cn/zYl8TMG 这是作为好消息来报导的，请勿做为反面宣传材料。
不知道钱永健给他什么title？ 61岁的老博后？？
What Ever Happened to Douglas Prasher?
The first researcher to clone the gene for green fluorescent protein, but
who was passed over for the 2008 Nobel Prize in Chemistry, is back in
academic science.
By Bob Grant | February 26, 2013
3 Comments
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Prasher's profile picture fr... 阅读全帖 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 2 一个knock in 的老鼠，目的基因与GFP融合表达。我的目的是让GFP和其它抗体共染色。
发现如下：
Harvest tissue，fix with 4% PFA overnight at 4 degree，切片后GFP无需染色可见
微弱信号，但是其它的抗体无法染色
如果直接用OCT在干冰上速冻，切片后再用4% PFA固定，其它抗体染色没有问题，GFP的
直接信号不可见，GFP抗体染色后一片smear，但是与control无GFP的tissue相比可明显
看到smear的GFP信号。
如果fix with 4% PFA for 2 hours at RT，然后incubate with 30% sucrose
overnight，那么GFP和其它抗体的染色都没有问题。
虽然我根据别人的protocol找到了解决的办法，但是一直想不清楚为什么。
为什么4% PFA固定过夜其它抗体就不能染色？为什么速冻后再用4% PFA固定，GFP信号
减弱或者变得smear？为什么固定两小时再用sucrose处理，则GFP和其它抗体的染色都
得到恢复？
大牛出来解答一下原理。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 3 诸位达人们，困扰我的问题请教。构建GFP融合蛋白，GFP放在C段，GFP的ATG需要除掉
吗？不除掉的话细胞会不会把GFP前面我的基因当作5'utr 而只翻译free GFP出来吗？
一个lab mate构建GFP融合蛋白，GFP放在C段，WESTERN检测发现既有融合蛋白也有free
GFP,这如何解释？ |
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S*****s
发帖数: 287 | 4 I think it is project dependent, and probably investigator dependent, so it
is my personal opinion here. In mammalian cells, GFP shows up as soon as it
is translated, so it can be hard to tell membrane expression from
cytoplasmic expression. In my study, the wild type protein had efficient
membrane trafficking, and mutant protein decreased trafficking efficiency.
GFP fusion protein was not able to show the weak membrane expression of the
mutant protein. When I used HA-tagged protein, I detected ... 阅读全帖 |
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L***s
发帖数: 133 | 5 因为要做很多形态学的东西，所以必须要染色work。
我用了GFP antibody，见上贴。试过几个，结果是Invitrogen 的rabbit anti-GFP明显
好于Aveslab的chicken GFP，invitrogen的mouse anti－GFP最差，非常弱。您感觉
Roche mouse anti-GFP和Invitrogen 的rabbit anti-GFP相比如何？
Thanks！ |
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x****u
发帖数: 530 | 6 谢谢大家的回复。
下面这篇文章是说GFP half life是2.8h吗？
Automated live cell imaging of green fluorescent protein degradation in
individual fibroblasts.
Halter M, Tona A, Bhadriraju K, Plant AL, Elliott JT.
Source
Abstract
To accurately interpret the data from fluorescent proteins as reporters of
gene activation within living cells, it is important to understand the
kinetics of the degradation of the reporter proteins. We examined the
degradation kinetics over a large number (>1,000) of single, living cells
from a... 阅读全帖 |
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x******3
发帖数: 111 | 7 现在正在做WB 检测GFP-Tagged的目的蛋白的表达，尝试了6种GFP 抗体，发现在人的细
胞中都能够检测到GFP 表达，但是在鼠的细胞中只有ABCAM的AB13970检测到GFP 表达（
但有其他一堆杂带），其他的抗体都能看到一堆bands，唯独没有GFP 的bands，主要是
砸带太多，曝光不能爆太久。
有大神能帮忙介绍一下在小鼠细胞中WB检测GFP 表达的经验吗?
不能用目的蛋白的抗体因为做的目的蛋白的truncated protein。
那个abcam的ab13970是鸡抗体，不知道怎么样去优化？（4%BSA block， 400mA/2hrs
transfer）
非常感谢！ |
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A*******e
发帖数: 284 | 8 Thanks to kelvincsc. I do not understand how this GFP-free peptides come out
. You mean there will be free gfp for any GFP-fused proteins? In this case,
subcellular localization using GFP fused protein will not work. You know,
free GFP, even very less, will disturb the protein subcellular localization
data. |
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A*******e
发帖数: 284 | 9 Thanks to sunnyday. I know it's all right for western. However for protein
subcellular localization, it will not work if all gfp-fused proteins have
free gfp signal. There are lots of papers with protein subcellular
localization results from GFP-fused protein. If there is free gfp signal for
all gfp-fused protein, what's mean of these results? |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 1. not everybody is as careful as you or me.
2. they usually still put in a negative control of free GFP
When there is a ATG in front of the GFP, there is always a chance that you
will see free GFP getting expressed, no matter with or without IRS.
However, even removing the ATG and the IRS all together, sometimes you still
see the free GFP showing up on western blot. We believe that is because the
linker sequence between your protein and the GFP suffered a proteolytic
cleavage
for |
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b*********8
发帖数: 44 | 11 非常感谢大家的回复。我想做2个蛋白的互做，一个连了GFP，一个连HA。 请问:
1.用GFP钓HA好哪还是用HA钓GFP好？
2. 如果没有好的GFP的抗体做Co-IP，可以用HA的抗体来IP，在WB检测GFP的蛋白是不是
会好点？
3. Roche的HA抗体应该还不错吧？ |
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s********e
发帖数: 33 | 13 我们研究的X由于没有好的抗体一直不能做染色，所以做了一个把X和GFP融合在一起表
达的老鼠，这样
通过GFP来显示我们研究的X的表达部位。
请做过小鼠GFP组织染色的xdjm推荐一款好用的GFP抗体。
谢谢 |
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n**********s
发帖数: 228 | 14 研究的基因是一个酶，很简单的knock in模型，就是将GFP-Neo同源重组到基因的第一
个exon前面，这样homozygous的老鼠该酶实际上是knock out的。
理论上GFP表达细胞是受该基因调控的，现在的结果是，在已知正常情况下该基因表达
的器官，homozygous的老鼠GFP细胞数大概是heterozygous的2倍多，比较的是相似位置
的切片，做过统计，基本上是这个结果。
请教这种现象准确原因是什么？Allelic Imbalance造成的吗？好像没什么理论基础支
持这个？另外，该基因也不存在明显的imprinting，应该不是这个原因吧。请高人指教
！ |
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n**********s
发帖数: 228 | 15 就是这个纠结啊，一开始看到结果，直接就想到是copy number 的原因， 但是我觉得
用上面那位同学的解释似乎更合理些，heterozygous的细胞，表达GFP那条allele是随
机的，因此GFP positive的细胞数目有个变化范围。
用copy number来解释，感觉不太有说服力，我觉得是不是平均单个细胞的GFP荧光强度
总体来说，homo比heterozygous平均强一些，用这个来解释更合理些？
是直接的显微镜下拍摄照片进行的荧光计数，设定个阈值，高于的就算阳性，因为这个
实验相当于验证这个敲入模型的准确性，所以才做的一个相当于“对照”性质的实验。 |
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L***s
发帖数: 133 | 16 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 17 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 Roche mouse anti-GFP 的信号还是很不错的，我只在WB用过invitrogen rabbit anti-
GFP,信号很强，但是杂带比较多。
但既然你是在老鼠里面做，用mouse anti-GFP的一个考量就是下面接着用的二抗
有可能会对血管和血细胞染色。所以你还是继续用rabbit 吧。
Abcam rabbit anti-GFP是我用过的最好的抗体，既特异，信号也强，唯一的缺点就是
特别贵。 |
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H***3
发帖数: 61 | 19 我的情况跟前一段时间讨论的一个情况不同。
转基因植物携带overexpression promoter+gene+c terminal GFP，转到野生型里建立
过量表达突变体。基因是核编码的叶绿体蛋白，蛋白N末端一个小酞段引导蛋白
targeting到叶绿体内行使功能。根据抗性筛选到homozygotes,confocal下检测到GFP信
号在叶绿体里，非常阳性。DNA genotyping和RT-PCR检测到基因插入正常，mRNA正常，
现在的问题是western用anti－GFP抗体无法检测到全长蛋白，只有GFP大概27kD左右的
信号。因为是未知蛋白，没有特异性抗体，突变体性状也没有发表过，所以无法确定是
否融合蛋白正确表达。我唯一能想到的是蛋白合成后，送到叶绿体内被降解了。可是即
使有降解，不会全都降解吧。
请大家给点意见，好不容易建立的突变体，实在不想放弃。 |
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e***o
发帖数: 344 | 20 I thought for FRET, it is 10 nm. How about split gfp/BiFC? Thanks！
People are using split GFP (called GRASP) to reconstruct pre/post synaptic
split GFP and get good signal. The distance of synapse is around 20-40nm.
The extracellular part of XFG isnt big. I am wondering 10nm is good for split gfp/BiFC?
low |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 我说很多，是指有很多这样的情况，不是指GFP的百分比很多。
当然,GFP fuse的蛋白定位有很多问题。通常的解决办法是做KO，
然后用GFP fusion rescue表型。不过严格来说，就算localization
不太对，如果GFP fusion表达量很大的话，有些时候也能rescue |
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R*s
发帖数: 2041 | 24
Normally it takes 3-5 hours after transfection to express enough GFP protein
in cells to get detectable fluorescence. Another trick is that it will take
about 3 hours for the fluorophore on GFP to be oxidized so that it can be
fluorescent. As far as I know, the quickest detection of GFP (or other
living fluorescent variants from Clontech) is around 8 hours after
introduction of DNA. The earliest time I ever tried is 10 hours after
transfection, but it is weak.
However, if you really want to see |
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no
发帖数: 560 | 25 单抗的话，Roche的非常好，据说AbCam的单抗和多抗都不错，但价钱都很贵，多抗里面cl
ontech自己的多抗就挺不错，不过得是对GFP fulllength的那个，另一个peptide Ab效价
太低，不好用。以上的抗体在WB和IP都很好使。
但是，单抗的问题在于protein folding和epitope exposure，我们有几中GFP的融合蛋白
，蛋白折叠的构象使其不能被GFP单抗IP，甚至不能在WB中被识别，只能用多抗。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 27 不应该。有很多文章用 GFP 标记膜蛋白。不过用 GFP 标记蛋白合成出来之后就有信号
，很多荧光信号在 ER 里面。我更喜欢用 HA 或者 FLAG tag 标记蛋白，然后用荧光标
记的抗体做染色，这样能看膜表达也能看全细胞表达。要是你用 GFP 标记蛋白可以直
接做 live cell imaging，看你具体要做什么实验了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 有专门为膜蛋白设计的GFP variant, 比方说Us9-GFP
而且即使是一般的GFP, 如果把linker设计得长一些，然后把荧光蛋白放在C terminus,
一般还是能有信号的。
Luciferase 不适合作为一般的光学成像，最好不要用。 |
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H******d
发帖数: 13 | 29 Thank you all for your suggestions!
Bingo! I succeeded in observing the GFP-localization of in nucleus.
The project seems in a good stage right now. Probably, this unknown function
protein is a DNA binding protein. Since completely unknown function and no
idea about the potential DNA target, I am thinking of that protein-DNA pull-
down assay might shed some sort of light. Actually I raised both functional
GFP and Myc tagged transgenic lines. If the tagged protein is labeled with
the affinity tag... 阅读全帖 |
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x****u
发帖数: 530 | 30 GFP表达之后，容易被降解吗？
如果一个蛋白融合GFP之后，蛋白降解是否一定会导致GFP也一起降解了？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 31 GFP非常稳定，通常不稳定的蛋白和GFP fuse以后都会变稳定。
降解以后也常常还留着GFP，你跑下wb就知道了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 关键要看用哪个抗体。
如果是用clonetech 的anti-dsRed， 原则上和GFP不应有cross-reaction.
而且不管厂家的数据如何，你自己应该有双重cross-reactivity test,
GFP protein + anti-RFP antibody,
以及 RFP protein + anti-GFP antibody
两个对照组。
在猴年马月之前我测试过一次，在WB结果还挺不错基本没有交叉识别。
但是免疫染色我就不知道了。你最好自己亲自测试一下。 |
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d****7
发帖数: 109 | 33 同上，要是做IP的话，没有好的GFP抗体
abcam的ab290只能说凑活,能IP下来，但是这抗体不是很特意，杂带多
不用抗体的话，可以考虑GFP-Trap !
Francis Stewart家（就是那个BAC TransgeneOmnics的家伙）自己做的GFP似乎能ChIP-
seq，应该不错，想他们家要把 |
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h******n
发帖数: 52 | 34 拜读了longwoodwalk写的创业文章，觉得很不错。有个关于专利的问题 也有人已经问
过了，但没看到问答。他最早做IL-17 GFP 老鼠卖的时候，没有提到GFP 的专利问题。
请板上牛人回答下，这个GFP 不需要专利吗？ |
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w**f
发帖数: 38 | 35 To define MMTV-Cre expression pattern, I crossed MMTV-Cre mice with Rosa-YFP
reporter mice. Very nice GFP fluorescence signal was seen in ductal trees
of Cre-postive/Rosa-YFP (+/-) mouse mammary glands. I then isolated mammary
epithelial cells using the Stem Cell kit (Collagenase/Hyaluronidase
digestion). No GFP-positive cells were detected using FACS analysis. Can
anyone give some suggestions on how to preserve GFP for FACS? Or can anyone
recommend one good protocol to cut sections from frozen ... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 36 最近作split GFP， 发现荧光很低，同样的GFP质粒转染到293细胞里有很强的荧光信号
并且很夸张的cell pellet是绿色的。
记得有人说过split GFP 成熟很慢。
LUCIFERASE 好些。有高手给点建议吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 取决于你用的是哪个GFP, 如果是动物细胞里面用的，一般都是eGFP,
在clontech 的数据库里有。
如果是细菌里面用的，那可能是普通的GFP, 在pubmed里有 |
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D**A
发帖数: 311 | 39 GFP TRAP
超级高效，省时，非抗体
POLYCLONAL ANTI GFP，CLONTECH，效果比ROCHE的好很多，但是价格稍贵。 |
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e*******e
发帖数: 342 | 40 这几天老板让找一下有没有真核细胞用的、非融合表达GFP的DEST载体，只是用GFP来监测转化
效率，并不想作为标签蛋白。各位大侠，如有知道的，请提供信息，谢谢！ |
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k*******c
发帖数: 142 | 41 you will find little GFP-free peptides come out even there is not a RBS-like
sequence upstream of GFP: something may function as it is.
However, you should get the fused protein dominantly. Remove the ATG will
help a little bit.
Good luck |
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k*******c
发帖数: 142 | 42 最近构建一个porin-gfp fusion: porin is an out membrane protein; so, the
porin-gfp is not supposed to be fluorescent when they are transported. 是不
是这样呢？
如果用luciferase 是不是好些呢？
多谢 |
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k*******c
发帖数: 142 | 43 thanks for your replying.
we are using bacteria. what I found here:
Green fluorescent protein (GFP) is an ideal cytoplasmic marker because it
fluoresces only when located in the cytoplasm (19, 20). When GFP is targeted
to the periplasm through fusion with a membrane-spanning domain (MSD), it
fails to fold properly and does not fluoresce.
what do you think?
thanks again |
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a*****y
发帖数: 277 | 44 You are right. When GFP is in the periplasm it is not folded properly.
However some outer membrane, when expressed recombinantly, can be in both
inner membrane and outer membrane, in which case you'll see GFP Fluorescence
.
There are certainly other fluorescent proteins - I can not remember the name
now. it is called something like ilov or ilove or ilike...? |
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k****n
发帖数: 158 | 45 用g418筛选一个稳转的细胞系，抗性克隆里面gfp 荧光信号很弱，肉眼不可见，只有用
荧光显微镜照相才能看到，但是也很弱，问，这种现象普遍吗，用FACS筛选GFP细胞可
行否？
谢谢 |
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A*******e
发帖数: 284 | 46 手上做的transcript factor, 想找它调控的基因。打算用GFP融合该TF做chip-chip，
看能把谁的promoter拉下来。求推荐GFP CHIP-chip protocol或Kit。
本人以前没有做过这个，请指点，包括技术和idea。 有没有更好的办法找到被直接调
控的下游基因？ 多谢了. |
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H****s
发帖数: 301 | 47 这个想法不错，但是要注意一下GFP融合的问题，你是在N端还是在C端融合？这要结合
转录因子的具体情况来进行。因为很可能的情况是GFP融合以后导致转录因子活性丧失
（或者是活性降低）。如果没有融合导致活性降低的问题，你可以买一个随机片段
array，基本上可以很快调出来该转录因子的结合片段了。祝好运。
， |
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s******s
发帖数: 13035 | 48 最近在做了一个myoG promotor的GFP在老鼠细胞里面表达，
但是荧光很弱，所以打算做一个增强的系统，比如myoG-Gal4;
UAS-GFP一类的东西。请问有没有现成的系统别人做过的？如
果自己做，有哪些类似UAS/Gal4的敏感的转录增强方法 |
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l**********k
发帖数: 189 | 49 这是Allelic exclusion， 很正常。好多基因都有这种情况。至于一个细胞里面表达哪个
染色体上的等位基因，是随机的。在你的小鼠里面，heterozygous小鼠里某类细胞
的GFP＋比例是homozygous小鼠的30％－70％都是正常的。 |
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f***4
发帖数: 886 | 50 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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