K**4
发帖数: 1015 | 1 平心而论，Crispr的最初几次突破，包括98年，02年，05，06年的工作奠定了分子基
础，而zhang feng进入这个领域实在太晚了。 |
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z*t
发帖数: 863 | 2 不过TCR没有了残留下来的T cell activation 是不是就不好使了？
但是用Crispr screening来找增强肿瘤免疫的分子倒是可以，记得之前nature上有一篇
类似的in vivo screen的paper |
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m****a
发帖数: 270 | 4 感觉Feng Zhang就是个做技术的工匠，不管是开始的optogenetics，还是后来的TALEN
，最近的CRISPR，他都是在改进和实现技术。即使拿不了诺贝尔，他还是做出了非常大
的贡献的。 |
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l********n
发帖数: 62 | 5 请问各位大侠
像CRISPR/CAS9之类的基因编辑技术，从理论上讲，是否可以通过将癌突变位点修正的
方式治愈癌症？
用纳米微胶囊将CAS9蛋白deliver到癌细胞中，在理论上是否可行？ |
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r******g
发帖数: 600 | 6 见过crispr KO cell line的
貌似不难做～ 不过没有深研究
不知道怎么解决off target的问题了... 并且，貌似没有很好的control
老鼠身上的off target在breeding的过程中，自动dilute out了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 楼主说的是用那种做老鼠KO 的方法来做细胞，对，就是用那种１万多bp 长的质粒来做
，不是指CRISPR或者TALEN
arm |
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x********e
发帖数: 35261 | 8 这楼说的是CRISPR出现之前用同源重组做细胞系KO啊, 看标题 |
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s******r
发帖数: 1245 | 9 传统做法的筛出来的基本都是random的integration，跟药量没关系，光用暴力筛选是
做不出来的
crispr和talen的发展对做editing的作用非常大，原来不能做的基本现在都能做了 |
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k********n
发帖数: 756 | 10 在组织里转染了CRISPR和GFP, FACS了GFP细胞，提了DNA，如果想看又KO的效率，除开
PCR后送几十个克隆测序的方法， 有什么其他更快更简单的方法没有？多谢了！！ |
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T****a
发帖数: 409 | 11 我最近刚开始在做这个，强烈推荐这个网站。
http://tide.nki.nl/
我是将gRNAs连接到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒里，然后将连接成功的CRISPRs plasmid转
染到细胞中，再sort GFP positive cells for culture (sort 50,000 cells for 1
well in 12-well plate。等差不多长满了，取genomic DNA，PCR，再用PCR primer
for sequencing。
如果一切顺利，出来的sequence file应该是从gRNA起作用的地方开始有chaos。将
sequence file和guide sequence upload上去，这个网站就会很快计算出来mutation
percentage。 |
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j*b
发帖数: 341 | 12 一年半前我试过这个，没见显著提高。其实crispr 本身效率已经很高了 〉40% 同源重
组。 |
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j******i
发帖数: 939 | 13 抑制癌细胞增长或使其凋亡？设计了一个CRISPR载体，可以同时敲掉3个基因，准备拿
来在cancer上玩玩。请教，如何是好 ：） |
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d*******3
发帖数: 8598 | 14 CRISPR的整合入基因组，难道不会引发肿瘤等 安全性能问题么？ |
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s***e
发帖数: 5242 | 15 The CRISPR-Cas9 editing technology was publicly described in the journal
Science in 2012 by Jennifer Doudna, a biologist at the University of
California, Berkeley, and the French microbiologist Emmanuelle Charpentier.
But Feng Zhang, a scientist at the Broad Institute, was first to win a
patent on the technique after submitting lab notebooks he says prove he
invented it first. |
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s***e
发帖数: 5242 | 16 multi-billion-dollar business.
Improved versions of CRISPR-Cas9 have already been invented, and entirely
new methods are likely.
. |
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T*G
发帖数: 600 | 17 他现在是最有可能那炸药奖的，而且两次机会，和他phd 老板那optogenetics或者
crispr |
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s******8
发帖数: 2131 | 18 Crispr Wikipedia 里好像没提到张峰？ |
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S*********e
发帖数: 127 | 19 For nobel, ZFN, TALEN and CRISPR will share the medal. There is no chance
for Feng Zhang at the moment. |
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b****r
发帖数: 17995 | 20 方法便宜简便了，自然会有更多人更多资源投入到这个方法的改进上。一旦如你所说
deliver方法突破，接下来确实不可限量
ZFN TALEN 做起来那么贵那么蛋痛，而且目前和CRISPR 一样也不好deliver，必然是曲
高和寡啊。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 21 TALEN仍然在价格和速度上与crispr有若干倍的差距 |
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c*******0
发帖数: 190 | 22 Then the Nobel prize may not be awarded to CRISPR/Cas9 in near future... |
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s******c
发帖数: 331 | 23 因为ethical issues被nature和science拒了，就发到了protein&cell这个饶子和搞的
杂志上了，不管如何，这下子这个open access的杂志算是出名了一把。
我觉得国内还是什么都敢做啊，这种东西是不是ethical真的就是一线之隔，他们号称
用的是因为基因缺陷不viable的embryo的cells，但是大家都知道国内那些小医院去搞
一个viable的embryo是多么容易的事情，再加上crispr的方便容易，在正常embryo上做
gene editing真是没什么特别的难度，除非法律有明确的规定。那篇nature的comment
里还特别提了，国内好几个组在做这个，至于用的是什么样的embryo，估计大家都不知
道。 |
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l*******i
发帖数: 153 | 24 首先我明确自己的态度：反对现在做这样直接修饰human embryo的实验。
但是，如果大家还有印象的话，几周前，有人在版里贴了一个新闻，说是Church实验室
正在用CRISPR技术修饰human embryo，而且是一个中国女博后牵头的。当时外界的反应
似乎比现在要积极。为什么现在中国的实验室先做出来了，大家都一致批判了呢，质疑
伦理问题？Nature上的评论，有的说得很直接，而且与计划生育牵扯到一起。
另外，说这个价值不大的，那是低估了这项实验的巨大影响力。”设计婴儿“不久之前
还只是科幻电影中的桥段；再联想到去年谢晓亮与北大三院合作，运用单细胞测序技术
，”筛选“出健康婴儿的事实，大家难道还没意识到”设计婴儿“眼睁睁地几乎变成现
实了吗？
科学的发展，总是领先伦理一步。研究者不应忽视伦理，但是如果囿于伦理的限制，那
么科学也不会进步。特别是医学，总是在一次又一次突破当时的伦理限制中进步的。
这次，也不例外，也无法避免。 |
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c*******i
发帖数: 951 | 25 同意。目前CRISPR最可行的医疗用途是CAR-T/immuno-oncology。貌似Juno之流已经开
始作了。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 26 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
selection marker，基本上指望不大。
生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
花了。
谢谢上次给我出主意的人。我现在也算CRISPR的“专家”了。：）。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 27 想起我一朋友用CRISPR在果蝇里做SNP的点突变。很快就做出来了，突变率还特别高，
大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 28 仔细看了一下，是2014的--precise gene deletion and replacement using the
CRISPR/Ca9 system in human cells。 |
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L*****e
发帖数: 288 | 29 同问～
这个SCR7的原始cell paper都有问题，目前也没有人能重复出来。
至于在CRISPR/CAS9效率上，有人尝试成功过吗？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 30 是。从single-replacement的“Wildtype"copy情况看，两个guide sequences都起了作
用。之所以加引号，是因为没有真正的wildtype，两个dsb上独有indels.
本意是让想用CRISPR作point-mutation的注意risk,没有筛选的情况下概率太小了一些
。我自己的概率是1 out of 1000左右呢。我看了biotechnique的那篇文章，也差不多
。所以，提醒一下。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 31 我的donar上没有筛选标志，也想用crispr跟ssODN做knockin，按照你说的效率极低，
heterozygous的效率都只有千分之一，那homozygous是不是没戏了？
要是你会挑多少克隆试试呢？
非常感谢。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 32 对CRISPR 的细节不清楚，只是想了解下，理论上你这个点突变的方法（或者其他已有
的点突变方法）有没有可能做到很高的效率，比如80%之类的？或者哪怕是30-40%？ |
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C****n
发帖数: 79 | 33 基于resistance marker 得到转化子，也就是说CRISPR 两个 components 在里面，但
是target没有突变。 |
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K**4
发帖数: 1015 | 34 crispr系统本省就是来源于Archaea的，它作为toxin system to fight against virus
(phage),这个方向的研究很多。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 35 （这个问题本来是放在另一网友的回帖里的，没有人注意或回答，就再拉出来示众。）
转化（transfection)效率低的话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个是siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题（不能超过十天左右），也就是transfection后不能等太长。而
CRISPR/cas9是permanent genome editing，没有时间问题；同时又不能保证
transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想... 阅读全帖 |
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m********2
发帖数: 317 | 37 Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
22.
Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
有同学用过这篇文章提到过的质粒吗?
我用了，但是不workwork，包病毒的时候能看到293T细胞全部绿了，但是收集的病毒
titer非常非常低，根本不能重复文章中的转染效率。 |
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m********2
发帖数: 317 | 38 Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
22.
Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
for the original virus we have been using standard calcium phosphate
transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
vector:psPAX2:pMD2.G.
The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
concentrated 50-100x with ultrazentrifuga... 阅读全帖 |
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S***J
发帖数: 1210 | 40 别说，这次我跟你老想到一块去了。人家美国人用尽各种办法帮这个女的造势，就是要
拿crispr的大奖。日本人提前批准PD1抗体药上市，也是为了自己人能拿cancer
immunotherapy的大奖。咱中国现在那么多钱，为啥不能给zhang feng和chen lieping
各发一些奖项造造势？！ |
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b******k
发帖数: 2321 | 41 老实说 crispr发奖有没有张峰可以讨论 要是没有doudna那真是天理不容了吧 |
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j******i
发帖数: 939 | 42 同意。Doudna是做RNA结构的，根本不懂bacteria. Carpentier是做bacteria出身的，
虽说是合作，卡彭特的作用更为关键。Doudna是运气好，她触及CRISPR是因为有人在
bacteria看到了一些奇怪的RNA序列而找上她。然后，她开会遇见卡彭特，卡彭特正好
在做这个东西，而结构什么的不是她专长，所以两就开始合作了。 |
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i***9
发帖数: 106 | 43 能具体的讲一下整个的流程么？
看了您之前的帖子，说CRISPR不需要ES cell，具体是怎么做呢？
好像目前最新的方法就是Zhang F去年的cell的文章了，用Cas9稳定表达的老鼠来做。 |
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k********n
发帖数: 756 | 44 I am planning to create virtue diseases by CRISPR knockin mutationS in human
iPSC lines.Anybody can give some references and thoughts? |
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j******i
发帖数: 939 | 45 做ipsc和CRISPR的人都挺多的。你不妨先介绍一下你自己的计划，别人才好说起。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 46 求问板上大牛关于用CRISPR做transcription activation
主要疑问是关于dCas9-gRNA binding site
文献上说法一般是在transcription start site （TSS）上游
激活特定基因的 会在TSS上游挑选8-10个位点 逐个测试挑个好的
genome-scale的话 一般就是每个位点挑3-5个位点
目前我们打算是做target pathway level activation （20-30个基因） 如果每个位点
都要搞个5-10个 工作量挺大的 又不能像genome-scale那样把所有DNA混起来
问题1.貌似TSS不是很清楚，有些基因有多个TSS，有这方面的数据库不？最好包括酵母
、老鼠以及人的
问题2. binding site有没好的软件可以预测？做knock-out的有，貌似做activation没
见到过？有啥推荐的不？ |
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C****n
发帖数: 79 | 47 先感谢版上的各位大虾，经过trouble-shooting，CRISPR在我们这个真菌里总算work了
。不过现在有个现象我解释不清楚，由于本人遗传学不是很强，所以想再次请教一下专
家。
我拿到单mutant后，sequence了target，但是很奇怪，sequencing结果显示我们这个
diploid的真菌只有一个单一的mutated target，这是为什么呢？NHEJ是随机的，理论
上说， diploid应该会出现两个allel不同的情况。是发生了gene conversion了，还是
其他原因？谢谢 |
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f********e
发帖数: 15 | 48 最近在做CRISPR突变，得到一些indel mutation。因为是hetrozygous， 所以不做TOPO
cloning就看不出每一个allele的序列是什么。
记得以前有人曾经提到过用一个软件可以直接分析heterozygous的indel mutation序列
，只是现在记不得了，不知有人知道有什么样的免费软件可以进行这方面的分析？另外
，这样的准确度有多高？是不是就不用TOPO cloning了？ 多谢指教！ |
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Q*****G
发帖数: 638 | 49 想在目的基因的N端或C端knockin GFP
利用cas9n d10a 载体，分别克隆２ guild RNA。
Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。５＇和３＇flank分别为８００bp左
右.转染（LTX／Fugene HD）完３天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱，还可以做细
胞分选么？
通常转染后多久细胞分选?
是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率？
谢谢 |
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h*****5
发帖数: 3 | 50 请问大家有谁知道哪家生物公司提供在癌症细胞中用CRISPR 技术 knock out genes 的
服务？
我查了一下，GenScript 可以，但是不知道质量如何？还有别的推荐的吗？
我要做的基因没有已经在细胞做好的，所以只能custom made.
谢谢大家了。 |
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