f******g
发帖数: 1003 | 1 请问哪里能够买到CRISPR/Cas9小鼠文库（sgRNA).
或者有现成的软件设计sgRNA
谢谢 |
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l*******r
发帖数: 63 | 3 各位大佬： 现在有好多家的crispr/cas cloning kit, 不知道哪家的好用？我想做一
个sufrace protein的deletion.
多谢！ |
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a****d
发帖数: 1919 | 4 借贴问一下，用Crispr建reporter hESC cell line， 哪个方法/kit更好用？ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 5 牛牛们，如果一个基因knockout在老鼠中导致胚胎发育死亡（拿不到纯合子）
那么能在细胞系中crispr敲除这个基因吗？
谢谢 |
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p*******r
发帖数: 59 | 6 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗?
Cutting cas9 的off-target 可能性大吗？
293T细胞如果有９０％的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有
多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做
一下预实验看看基因作用？像siRNA一样用?
有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的？
Thanks! |
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t**l
发帖数: 109 | 7 看你的实验目的了，如果你的实验结果是在293T上做，phenotype可以快速的看到，可
以不做筛选。但是这样的phenotype并不是KO.我觉得如果想快速的看看是否有作用，可
以。但是早晚还是要pick single cell clone. 来验证。要不是CRISPR这个技术就浪费
了。除非你是做screen. |
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a***y
发帖数: 19743 | 8 感觉不错，可以考虑设计使用crispr或talen的实验…
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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a*****n
发帖数: 2835 | 9 CRISPR很有用，但是感觉还没有能够取代RNAi |
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w*********d
发帖数: 82 | 10 谁有CRISPR mutation的经验可以分享？
先谢了！ |
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w*********d
发帖数: 82 | 11 多谢Thymine师兄！
我们想做的是，将人的macrophage细胞用CRISPR突变一个受体（TNFa），然后刺激细胞
，对照突变细胞和正常细胞的信号通道有没有改变。试图研究这个受体在类风湿病中作
用。
请Thymine师兄提提建议。 |
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s********x
发帖数: 472 | 12 CRISPR还需要什么特别的经验么？这个技术的牛叉之处就是非常robust。
做knock out knock in 很容易。 如果做knock up可能需要些trick。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 13 但CRISPR的特异性会是个大问题。而且人体的副作用究竟有多大，现在没有一点概念啊。 |
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r******g
发帖数: 600 | 15 crispr off-target太多了
我怀疑它能被运用到人身上的可能性
ZFN-editing 现在在临床实验中啊～ Carl june搞的，效果不错的 |
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l*******e
发帖数: 170 | 16 我现在在做一个抑癌基因，想在基因组的范围内筛选和这个抑癌基因的genetic
interaction.
我知道有CRISPR的library，但没有实际经验，所以想找几篇相关文章看看
或者谁有实际经验传授一下也很感谢。 |
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V******t
发帖数: 444 | 17 同求问。我正在做screen，原来是用Haploid 细胞＋piggyback 做forward genetic
screen
现在也打算用CRISPR。求科普＋八卦 |
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c*****u
发帖数: 439 | 19 挺好的文章。但是之前已经有人用shRNA做in vivo screen了，所以这个重要性可能就
没有特别大了，但是也许CRISPR的敲除更干净，所以能发现更多有意思的东西就不知道
了。
还有一个问题，其实AAV可以放下一个Cas9, 而且据说转染效率很高。这样的话，其实
可以AAV-Cas9 和 AAV-gRNA 一起打老鼠好了。 所以，没有必要做老鼠？ 也许我理解
有错误，对于AAV。 |
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H****N
发帖数: 997 | 20 "我发现重组修复后，如果精确剪切和连接，会产生一个完全相同的CRISPR位点"
这种可能性非常小吧， 因为剪切后，连接前，总会有些碱基被削掉 |
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d****u
发帖数: 1553 | 21 CRISPR引起的DSB是由NHEJ来修理的，这个过程应该说是超级的不精确，删除的碱基数
从几个到10几个到几十个不等。你这个精确剪切的概率应该是非常非常低的。 |
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p*******i
发帖数: 449 | 22 非常感谢各位的解答指点。
我太喜欢这个不精确的修剪了。 谢谢各位，我可以继续放心去筛了。我以为我需要修
改其中一个CRISPR的序列。
分子生物学的东西博大精深啊，我这种就知道个皮毛的纯生化出身，真是放眼四处皆学
问啊。 |
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l***s
发帖数: 841 | 23 CRISPR效率还是蛮高的，对于一般cell line两个基因copy不在话下。我们90%的cell两
个拷贝都能敲掉（通过lentivirus infection）。 当然这和gRNA关系很大，设计不好
效率会低不少。 |
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t****w
发帖数: 130 | 24 想用CRISPR在干细胞里边突变一个基因，这种情况一般是自己从头到尾自己做呢，还是
找公司做出质粒自己来挑克隆呢？ 本人新手零基础，自己做估计要折腾4~5个月，如果
公司做一般要多少时间 多少钱啊？ 谢谢！ |
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s***o
发帖数: 1189 | 25 你要是以后还会用CRISPR就自己做,
要不然,偶尔喝杯酒,没必要自己从头开始酿. |
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h********1
发帖数: 157 | 26 我知道harvard的有那个human基因的crispr target seq library （就是那个ＮＧ
Ｇ的特异序列），之前用它设计gＲＮＡ(arep.med.harvard.edu/human_crispr)。现在
改做老鼠了，不知道哪里有老鼠的library。多谢了！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 27 crispr.mit.edu
zhang feng lab的 |
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h********1
发帖数: 157 | 28 我知道harvard的有那个human基因的crispr target seq library （就是那个ＮＧ
Ｇ的特异序列），之前用它设计gＲＮＡ(arep.med.harvard.edu/human_crispr)。现在
改做老鼠了，不知道哪里有老鼠的library。多谢了！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 29 crispr.mit.edu
zhang feng lab的 |
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w*********n
发帖数: 439 | 30 各位大侠，小弟刚开始学做Crispr
请问如果要使用homolog Arm做HEJ的话该用Cas9还是Cas9D10A? |
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m*p
发帖数: 226 | 31 有商业化的用CRISPR 或者 TALEN 来做knockin 吗？请给个链接或电话。 谢谢！ |
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s******9
发帖数: 283 | 32 可能CRISPR的原创性贡献就这样定调了，以后就没什么好争吵的了。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 33 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
ssDNA在真核细胞内不如dsDNA的plasmid稳定... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 嘿嘿，准备赌一把。
我这个要mutate的基因是我要用的host cell生长必需的，是一个激素受体。mutant呢
，据说不需要激素也有活性了。所以，就想用没有激素的medium来筛选。希望wt的长不
出来或很慢。
另外，和老板谈了一下，理想状态是两个拷贝都mutate.但一个也能接受。我在想，要
是一个拷贝被knockout,一个被mutate也行。所以，strategy上，我想用两个guide
sequences.两个相距不远，大约是40 bp away。老板让我线赌一把，实在不行，就分两
步，先作stable cell line, 把mutant在这个细胞里表达，然后再来个CRISPR
knockout。
多谢你的指导和建议！这里真不错，都是同行，能相互学很多东西。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 35 不知道crispr啥protocol，以前实验室产病毒，293T也是不能confluent |
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d******u
发帖数: 238 | 36 Zhang现在和大佬们（Doudna，Church）为CRISPR黑脸了，会给以后发展带来不利。 |
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a***y
发帖数: 19743 | 37 这些专利究竟是专利了什么？
CRISPR-Cas9的原本生物功能不应该被patent
但是实用它们来做一些超出原始功能的方法应该可以patent
但是问题是总的来说，这个技术实在是太简单……
等着看官司 |
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A******y
发帖数: 2041 | 38 You guys worry too much. If you are in academia, you can just ignore the
patent as long as you don't somehow commercialize it. As using CRISPR for
therapeutic needs, you have to be very gullible to believe it. We cannot
even get siRNA into humans, now you want to put a 10k plasmid in it. It
could work to correct genetic defects at zygote stage but you are bordering
on unethical science because what happen if someone decide to make a super-
human. |
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c****1
发帖数: 1095 | 39 有人做过lenti-CRISPR么？有没有同时用两个gRNA的？好像没看到这方面的文章。
是不是最好一个U6，一个H1？有没有现成的质粒？
多谢！！ |
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C*********h
发帖数: 83 | 40 Crispr/Cas 不需要ES cell.
我们都是直接运小鼠到美国 |
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j********r
发帖数: 156 | 41 which CRISPR vector(S) have you used to introduce single AA mutation? There
are tons of vectors on Addgene, such as all-in-one vs cas9 and sgRNA in
separate vectors, regular or viral vectors. Any comments or protocol will be
highly appreciated! |
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h********n
发帖数: 4079 | 42 想在细胞里敲掉一些基因, 哪个公司的CRISPR产品好用又不太贵呢?
我刚刚看了santa cruz的
各位有啥推荐吗?
谢谢 |
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h********n
发帖数: 4079 | 43 想在细胞里敲掉一些基因, 哪个公司的CRISPR产品好用又不太贵呢?
我刚刚看了santa cruz的
各位有啥推荐吗?
谢谢 |
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k****l
发帖数: 279 | 44 做construct，要切的地方没有合适的内切酶
想用NEB的 Cas9 做体外的 CRISPR来切质粒，需要sgRNA，网页上建议做 in vitro
transcription
不知化学合成 sgRNA oligo 是否可行，会有folding 方面的问题吗？
谢谢大家！ |
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b*****n
发帖数: 34 | 45 Novartis很明显要用CRISPR改进CD19CAR.
我感觉可能会敲掉T细胞本身的HLA和TCR，这样可以给所有病人用一样的产品，不用单
独扩增细胞。不知道这个想法靠谱不。
有前辈能点评一下其他可能的途径吗? |
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K**4
发帖数: 1015 | 46 平心而论，Crispr的最初几次突破，包括98年，02年，05，06年的工作奠定了分子基
础，而zhang feng进入这个领域实在太晚了。 |
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z*t
发帖数: 863 | 47 不过TCR没有了残留下来的T cell activation 是不是就不好使了？
但是用Crispr screening来找增强肿瘤免疫的分子倒是可以，记得之前nature上有一篇
类似的in vivo screen的paper |
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m****a
发帖数: 270 | 49 感觉Feng Zhang就是个做技术的工匠，不管是开始的optogenetics，还是后来的TALEN
，最近的CRISPR，他都是在改进和实现技术。即使拿不了诺贝尔，他还是做出了非常大
的贡献的。 |
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b*****n
发帖数: 34 | 50 Novartis很明显要用CRISPR改进CD19CAR.
我感觉可能会敲掉T细胞本身的HLA和TCR，这样可以给所有病人用一样的产品，不用单
独扩增细胞。不知道这个想法靠谱不。
有前辈能点评一下其他可能的途径吗? |
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