m*********D
发帖数: 1727 | 1 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
selection marker，基本上指望不大。
生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
花了。
谢谢上次给我出主意的人。我现在也算CRISPR的“专家”了。：）。 |
h***l
发帖数: 168 | 2 请问是哪篇bio techniques? selection marker 有时候不好引入啊。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
: 本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
: 友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
: 作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
: replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
: replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
: 刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
: selection marker，基本上指望不大。
: 生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
: 花了。
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x********e
发帖数: 35261 | 3 想起我一朋友用CRISPR在果蝇里做SNP的点突变。很快就做出来了，突变率还特别高，
大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 有一个月了，还没有来得及seq.确认。但酶切pattern表明了我拿到了。
: 本来以为可以发篇方法文章的。但Biotechniques已经出来了。作者里还有认识的老朋
: 友呢。方法上我们基本是同一个思路和设计，他们的统计数据和我的很接近。他们没有
: 作point mutation,就是方法上证明可行。基本上，没有selection marker, 拿到
: replacement的概率很低。我的统计数据就是transfected cell里面，单copy
: replacement的概率是千分之一左右，双copy replacement概率更低。
: 刚劝说了一个教授放弃他们的point mutation计划（一个博士后的project)。没有
: selection marker，基本上指望不大。
: 生物人太多，竞争太强了。我要不是这个mutation有别的用途，我这几个月时间就是白
: 花了。
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m*********D
发帖数: 1727 | 4 仔细看了一下，是2014的--precise gene deletion and replacement using the
CRISPR/Ca9 system in human cells。
【在 h***l 的大作中提到】
: 请问是哪篇bio techniques? selection marker 有时候不好引入啊。
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m*********D
发帖数: 1727 | 5 嘿嘿，你的bio论坛还没建起来呀？：）。你的能量真让我佩服，这么多论坛主题度有
你的身影。
反正是不容易。我这是给实验室的学生打基础的。游乐这些mutants，他们可以作自己
的research project。而我还得打酱油。
【在 x********e 的大作中提到】
: 想起我一朋友用CRISPR在果蝇里做SNP的点突变。很快就做出来了，突变率还特别高，
: 大家都兴奋得不得了。结果后来发现是cas9的line里面带了这个SNP。
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x********e
发帖数: 35261 | 6 你用了repair template吗
【在 m*********D 的大作中提到】
: 嘿嘿，你的bio论坛还没建起来呀？：）。你的能量真让我佩服，这么多论坛主题度有
: 你的身影。
: 反正是不容易。我这是给实验室的学生打基础的。游乐这些mutants，他们可以作自己
: 的research project。而我还得打酱油。
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r******g
发帖数: 600 | 7 楼主，问个naive question
你做point mutation 用什么办法select呢？
用的endonuclease来select吗？
成功率有多少？ |
m*********D
发帖数: 1727 | 8 当然。
【在 x********e 的大作中提到】
: 你用了repair template吗
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m*********D
发帖数: 1727 | 9 我能想出来的就是IRES接G418一类的。这就搞掉/改变了3-UTR一类的。不知道一个G418
的expression casseette能不能插到intron里。
Biotech的文章用的是GFP fusion.我用的是mutant的特性来select。
【在 r******g 的大作中提到】
: 楼主，问个naive question
: 你做point mutation 用什么办法select呢？
: 用的endonuclease来select吗？
: 成功率有多少？
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Z**********g
发帖数: 222 | 10 最近不是出来两篇Nat Biotech的文章吗，说是用小分子抑制NHEJ可明显增强HDR效率。
不知效果如何。 |
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h****a
发帖数: 65 | 11 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的genomic DNA吗？怎样快速的做从单克隆到
PCR鉴定这一步？
4. 你所说的transfected cells的单copy 的replacement是千分之一，那你在有
selection marker的情况下，单克隆能拿到heterozygous point mution的效率是多高
？ Homozygous的效率又是多高呢？挑多少克隆最后能拿到homozygous?
对crispr做mutation实在是太新手了，希望你能帮助解答疑问，不胜感激啊！！！ |
m*********D
发帖数: 1727 | 12 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的genomic DNA吗？怎样快速的做从单克隆到
PCR鉴定这一步？
**基本差不多。我用12-well plate,1 well来体genomic DNA.
4. 你所说的transfected cells的单copy 的replacement是千分之一，那你在有
selection marker的情况下，单克隆能拿到heterozygous point mution的效率是多高
？ Homozygous的效率又是多高呢？挑多少克隆最后能拿到homozygous?
对crispr做mutation实在是太新手了，希望你能帮助解答疑问，不胜感激啊！！！
**我原文说了，没有selection，heterozygous point mutation的效率在千分之一以下
。homozygous更低。有筛选，效率就高多了。
吗？
【在 h****a 的大作中提到】
: 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
: 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
: puro+)
: Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
: 你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
: Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
: 时候好像也不方便在donor上引入selection marker
: 2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
: 3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
: 在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
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m*********D
发帖数: 1727 | 13 还没看到呢。谢谢提醒。
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 最近不是出来两篇Nat Biotech的文章吗，说是用小分子抑制NHEJ可明显增强HDR效率。
: 不知效果如何。
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h****a
发帖数: 65 | |
j******i
发帖数: 939 | 15 那篇Nature biotech SCR7有谁可以重复出来吗 我用ZFN测试效果不大啊 |
L*****e
发帖数: 288 | 16 同问～
这个SCR7的原始cell paper都有问题，目前也没有人能重复出来。
至于在CRISPR/CAS9效率上，有人尝试成功过吗？
【在 j******i 的大作中提到】
: 那篇Nature biotech SCR7有谁可以重复出来吗 我用ZFN测试效果不大啊
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d*********s
发帖数: 7 | 17 点突变测序验证了吗？我正开始作。可以建议doner上怎么引入selection marker吗?
谢谢!
吗？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
: puro+)
: Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
: 你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
: Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
: 时候好像也不方便在donor上引入selection marker
: **我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
: 以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
: 生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
: 2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
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d*******3
发帖数: 8598 | |
m*********D
发帖数: 1727 | 19 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
还有约25%在酶切上看不出来，也没有sequencing它们，所以不知具体原因。Double-或
single-replacement mutant里面挑出来一部分作了sequence,证实了mutation.
希望我的经验多大家有帮助。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 点突变测序验证了吗？我正开始作。可以建议doner上怎么引入selection marker吗?
: 谢谢!
:
: 吗？
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d*********s
发帖数: 7 | 20 非常感谢! 你用了一个还是两个gRNA. Biotechnology paper用了两个.
replacement,
【在 m*********D 的大作中提到】
: 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
: ”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
: 吗？
: **是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
: 我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
: 位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
: transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
: 细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
: mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
: 约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
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m*********D
发帖数: 1727 | 21 我也用了两个。当时的想法很简单：1。不准备测guide RNA的效率，两个里有一个work
就可以了；2。两个guide RNA可以删掉一段很重要的序列，没有这个，细胞无论有没有
HDR,都不能生存，有利我拿到mutant.当然，我那个phenotype筛选可能是最有用的。
我不在乎off-target.我当时觉得，我要能拿到多个mutant,和stable cell line一样，
就五所谓了。我可以比较不同克隆来消除off-target的影响。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 非常感谢! 你用了一个还是两个gRNA. Biotechnology paper用了两个.
:
: replacement,
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d*********s
发帖数: 7 | 22 这么说，你设计两个px459载体(每个有一个gRNA)和doner一起转到细胞裏。是吗？
这个贴会让很多人受益。
work
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我也用了两个。当时的想法很简单：1。不准备测guide RNA的效率，两个里有一个work
: 就可以了；2。两个guide RNA可以删掉一段很重要的序列，没有这个，细胞无论有没有
: HDR,都不能生存，有利我拿到mutant.当然，我那个phenotype筛选可能是最有用的。
: 我不在乎off-target.我当时觉得，我要能拿到多个mutant,和stable cell line一样，
: 就五所谓了。我可以比较不同克隆来消除off-target的影响。
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m*********D
发帖数: 1727 | 23 是。从single-replacement的“Wildtype"copy情况看，两个guide sequences都起了作
用。之所以加引号，是因为没有真正的wildtype，两个dsb上独有indels.
本意是让想用CRISPR作point-mutation的注意risk,没有筛选的情况下概率太小了一些
。我自己的概率是1 out of 1000左右呢。我看了biotechnique的那篇文章，也差不多
。所以，提醒一下。
【在 d*********s 的大作中提到】
: 这么说，你设计两个px459载体(每个有一个gRNA)和doner一起转到细胞裏。是吗？
: 这个贴会让很多人受益。
:
: work
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p******b
发帖数: 379 | 24 您好， 请问您PCR之后是直接酶切鉴定还是说把PCR产物纯化之后再酶切？ 我也打算做
类似的实验， 考虑到要鉴定的克隆数量比较多， 如果需要纯化pcr产物再酶切的话，
工作量就大了很多， 谢谢 |
m*********D
发帖数: 1727 | 25 粗筛的时候，不用纯化。后面sequencing，我倒是从gel纯化酶切或没有切的条带。没
有酶切的条带（non-HDR)往往不纯，我有两个酶切点，倒是帮了点忙。
我粗筛是用genomic DNA--PCR。细筛和sequencing，我用得mRNA/cDNA--PCR.
，
【在 p******b 的大作中提到】
: 您好， 请问您PCR之后是直接酶切鉴定还是说把PCR产物纯化之后再酶切？ 我也打算做
: 类似的实验， 考虑到要鉴定的克隆数量比较多， 如果需要纯化pcr产物再酶切的话，
: 工作量就大了很多， 谢谢
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p******b
发帖数: 379 | 26 谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？ |
p******b
发帖数: 379 | 27 谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？ |
p******b
发帖数: 379 | 28 谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？ |
m*********D
发帖数: 1727 | 29 我用Q5作PCR,NEB的Cutsmart buffer作我的酶切。5 ulPCR到20 ul digestion。你要担
心这个，可以少用点PCR，2 ul应该可以。现在的gel拍片都可以enhance，所以，DNA量
少一点不会是问题。
【在 p******b 的大作中提到】
: 谢谢您， 不纯化的话， 酶切体系是怎么样的呢？ PCR的buffer会影响酶切吗？
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p******b
发帖数: 379 | |
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o**4
发帖数: 35028 | 31 我的donar上没有筛选标志，也想用crispr跟ssODN做knockin，按照你说的效率极低，
heterozygous的效率都只有千分之一，那homozygous是不是没戏了？
要是你会挑多少克隆试试呢？
非常感谢。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我用Q5作PCR,NEB的Cutsmart buffer作我的酶切。5 ulPCR到20 ul digestion。你要担
: 心这个，可以少用点PCR，2 ul应该可以。现在的gel拍片都可以enhance，所以，DNA量
: 少一点不会是问题。
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o**4
发帖数: 35028 | 32 这个效率好低啊，
千分之一不到，看样子难道要挑1000个以上的克隆吗？
replacement,
【在 m*********D 的大作中提到】
: 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
: ”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
: 吗？
: **是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
: 我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
: 位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
: transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
: 细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
: mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
: 约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
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m*********D
发帖数: 1727 | 33 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
你的基因后面。
按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
【在 o**4 的大作中提到】
: 这个效率好低啊，
: 千分之一不到，看样子难道要挑1000个以上的克隆吗？
:
: replacement,
|
o**4
发帖数: 35028 | 34 这个想法非常好，非常感谢，
我好好想想吧，感觉这个方法可行。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
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o**4
发帖数: 35028 | 35 请问一下你的donor vector咋设计的呢？是ssODN吗？用了多长的homologous arm呢？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
|
s********r
发帖数: 312 | 36 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。 |
d*********s
发帖数: 7 | 37 好主意。我是外行。 请介绍怎么避免loxp和抗性基因被spliced out. 抗性基因在
intron怎么被表达?
【在 s********r 的大作中提到】
: 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
|
m*********D
发帖数: 1727 | 38 我克隆到质粒里面的。一边一个1。2Kb的arm,中间是70bp的mutation region,正好两个
新的酶位点连接，作克隆用。
【在 o**4 的大作中提到】
: 请问一下你的donor vector咋设计的呢？是ssODN吗？用了多长的homologous arm呢？
|
m*********D
发帖数: 1727 | 39 其实，如果这个selection marker expression cassette不影响intron/exon splicing
,切不切出来都无所谓的。如果影响，一个essential gene就不可能了。我这次作的一
个基因就是cell growth essential的。
【在 s********r 的大作中提到】
: 用loxp带抗性基因，放到mutation位点附近的intron里去不就可以了。
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b****r
发帖数: 17995 | 40 对CRISPR 的细节不清楚，只是想了解下，理论上你这个点突变的方法（或者其他已有
的点突变方法）有没有可能做到很高的效率，比如80%之类的？或者哪怕是30-40%？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
: 不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
: 我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
: 你的基因后面。
: 按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
: 细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
: duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
: 盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。
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