H**O
发帖数: 89 | 1 我有3个ChIP，分别是IgG control，KD＋抗体，Scr＋抗体.已经做了library，现在要
混在一起在一个lane测序，要等量地混起来。
1. 请问这个等量是不是要非常精确？测序不是根据reads的数量来定量吗，那混的时候
差异会不会对结果影响很大？
2. 做好的library，用Qubit和bioanalyzer测出来的浓度不一样啊，该采用哪一个？
非常感谢！！ |
l*******i
发帖数: 153 | |
H**O
发帖数: 89 | 3 不是这个问题。index是加了的。
我是想问，混合的时候，是不是要精准地一样？不然定量还准不准？定量是直接比较各
组的reads数，还是有内参？
【在 l*******i 的大作中提到】
: 用barcode sequence区分这三组
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y*****3
发帖数: 961 | 4 各库的浓度要尽量的相等，测出的reads数才会越相近 |
i*****i
发帖数: 154 | 5 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
peak calling。 |
s******s
发帖数: 13035 | 6 1.要尽量准啦。不过只有三个样品，不准问题也不大。
2.应该是Qubit准。bioanalyzer低浓度有时候瞎算啊
【在 H**O 的大作中提到】
: 我有3个ChIP，分别是IgG control，KD＋抗体，Scr＋抗体.已经做了library，现在要
: 混在一起在一个lane测序，要等量地混起来。
: 1. 请问这个等量是不是要非常精确？测序不是根据reads的数量来定量吗，那混的时候
: 差异会不会对结果影响很大？
: 2. 做好的library，用Qubit和bioanalyzer测出来的浓度不一样啊，该采用哪一个？
: 非常感谢！！
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H**O
发帖数: 89 | 7 谢谢！input也要测啊？我没有做input的library 。
大。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
: 。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
: 但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
: 如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
: barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
: 此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
: peak calling。
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H**O
发帖数: 89 | 8 有没有内参校正呢？
Qubit在什么范围内比bioanalyzer准确呢？
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.要尽量准啦。不过只有三个样品，不准问题也不大。
: 2.应该是Qubit准。bioanalyzer低浓度有时候瞎算啊
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i*****i
发帖数: 154 | 9 如果你有高浓度的PCR产物的话，可以考虑用nanodrop，或者传统的石英杯子侧浓度。
然后做serial dilution,做标准曲线。
一定要用PCR产物，质粒不可以。用质粒结果极其诡异。
我自己做的library，一般10ng/ul, 总量100-150ng，Bioanalyzer还算准确。
如果能自己用bioanalyzer最好，如果是Core做的话，一定要注意峰的面积是怎么算的
，那个分析软件有时候很crazy。 |
H**O
发帖数: 89 | 10 谢谢指教。
你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
人说问题不大。
没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
genome吗？
【在 i*****i 的大作中提到】
: 如果你有高浓度的PCR产物的话，可以考虑用nanodrop，或者传统的石英杯子侧浓度。
: 然后做serial dilution,做标准曲线。
: 一定要用PCR产物，质粒不可以。用质粒结果极其诡异。
: 我自己做的library，一般10ng/ul, 总量100-150ng，Bioanalyzer还算准确。
: 如果能自己用bioanalyzer最好，如果是Core做的话，一定要注意峰的面积是怎么算的
: ，那个分析软件有时候很crazy。
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l*****i
发帖数: 1163 | 11 我也在纳闷，就是这种IgG或者其他Negative Control，理论上是不会有DNA的。怎么收
集到10ng的DNA。
另外有个问题就是如果我的样品有重复（2个生物学重复），Input需要重复么？
大。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
: 。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
: 但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
: 如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
: barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
: 此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
: peak calling。
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i*****i
发帖数: 154 | 12 对于qPCR定量，参考下面这个链接：
http://support.illumina.com/documents/MyIllumina/e4a1cd4c-9293-
或者放狗
Sequencing Library qPCR Quantification Guide - Support - Illumina
或者看看 KAPA Library Quant Kits
最好用KAPA的SYBR来做，便宜的 例如 Promega的SYBR干不了这么高端的活。
其实就是用通用引物来做PCR。
Reference genome应该是用来做mapping的吧。具体的我也不是很清楚，
你可以参考liu xiaole的网站，或者galaxy的教程
【在 H**O 的大作中提到】
: 谢谢指教。
: 你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
: 因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
: 我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
: 人说问题不大。
: 没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
: genome吗？
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k*****n
发帖数: 323 | 13 大概均分就好了，一定范围内都没问题的。qpcr测的是相对分子数目，比较精确，
bioanalyzer比Qubit准。 |
i*****i
发帖数: 154 | 14 IgG是可以pull down下来DNA的，甚至大部分时候和目的抗体pull down的DNA差不多 4-
5ng左右。
我们实验室的protocol很固定，所以我们觉得一个input可以用来分析所有的CHIP-seq
数据。有时候不同人用不同的protocol，或者用的细胞数量不一样，都会影响
sonication的效率，和片段大小，这样对input稍有影响，不过应该不是问题。
ChIP本来重复性就差，同一个人做相同的实验，seq结果能overlap 80%就相当好了。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 我也在纳闷，就是这种IgG或者其他Negative Control，理论上是不会有DNA的。怎么收
: 集到10ng的DNA。
: 另外有个问题就是如果我的样品有重复（2个生物学重复），Input需要重复么？
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: 大。
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k*****n
发帖数: 323 | 15 我一般input少load一些，大概是chip摩尔浓度的一半 |
j*p
发帖数: 411 | 16 1. input必须要，和用什么软件call peak 无关。
2. 如果没有input，MACS call peak 的时候，没有FDR。
【在 H**O 的大作中提到】
: 谢谢指教。
: 你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
: 因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
: 我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
: 人说问题不大。
: 没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
: genome吗？
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