h**********r
发帖数: 671 | 1 想给一个片段加个leader sequence,肯就20来个氨基酸，请问有啥好办法呢？
PCR之后酶切不太好回收吧
多谢！ |
j****x
发帖数: 1704 | 2 这种问题你还借什么人气，要借人气你得去军版/中新版哈
直接合成2条oligo然后退火，和目标载体连接 |
h**********r
发帖数: 671 | |
d****7
发帖数: 109 | 4 别急，如果合成两条互补链oligo然后退火的话，记得纯化方法一定要选最高的（HPSF
绝对不行，最好是PAGE纯化的），否则会有很多合成失败的垃圾影响接下来的连接。
还有，如果你是设计的oligo带overhang的话，记得用PNK给5'端加磷酸，因为化学合成
的5'端不带磷酸的，没磷酸是连不上的！ |
s******s
发帖数: 13035 | 5 好回收。用qiagen的nucleotide removal kit, 最小40bp，你的有60多了
【在 h**********r 的大作中提到】
: 想给一个片段加个leader sequence,肯就20来个氨基酸，请问有啥好办法呢？
: PCR之后酶切不太好回收吧
: 多谢！
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m*****z
发帖数: 1451 | 6 PAGE纯化的都不靠谱，最好是HPLC纯化的
pnk加磷酸不如直接合成带5'磷酸的oligo
这样基本上万无一失了，就是有点贵。
想省钱的还是合成2条primer故意让它们形成primer之间的dimer
PCR后酶切，跑个10%的non-denatured的PAGE，切胶后碾碎，用TE泡1小时或过夜，乙醇
沉淀，记得加点离子。
HPSF
【在 d****7 的大作中提到】
: 别急，如果合成两条互补链oligo然后退火的话，记得纯化方法一定要选最高的（HPSF
: 绝对不行，最好是PAGE纯化的），否则会有很多合成失败的垃圾影响接下来的连接。
: 还有，如果你是设计的oligo带overhang的话，记得用PNK给5'端加磷酸，因为化学合成
: 的5'端不带磷酸的，没磷酸是连不上的！
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s********8
发帖数: 619 | 7 没看懂...什么叫做两条互补链退火啊??? 我承认我很弱...
HPSF
【在 d****7 的大作中提到】
: 别急，如果合成两条互补链oligo然后退火的话，记得纯化方法一定要选最高的（HPSF
: 绝对不行，最好是PAGE纯化的），否则会有很多合成失败的垃圾影响接下来的连接。
: 还有，如果你是设计的oligo带overhang的话，记得用PNK给5'端加磷酸，因为化学合成
: 的5'端不带磷酸的，没磷酸是连不上的！
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N2
发帖数: 81 | 8 事情怎么弄的这么复杂
方法1: 直接设计在长引物里就好,IDT,100nmol,90bases
方法2: 2 oligos to form a adaptor with sticky ends and used in the ligation
directly without recovery , add 0.2u PNK in the ligation and you don't need
primer Phosphorylation
【在 m*****z 的大作中提到】
: PAGE纯化的都不靠谱，最好是HPLC纯化的
: pnk加磷酸不如直接合成带5'磷酸的oligo
: 这样基本上万无一失了，就是有点贵。
: 想省钱的还是合成2条primer故意让它们形成primer之间的dimer
: PCR后酶切，跑个10%的non-denatured的PAGE，切胶后碾碎，用TE泡1小时或过夜，乙醇
: 沉淀，记得加点离子。
:
: HPSF
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a*******a
发帖数: 4233 | 9 加磷干啥，浪费钱。载体是切开的两头就有磷了
合成的oligo加不加无所谓的。
最简单粗暴的方法
两条sequence，反向互补， 末端带粘性末端
干粉稀释成100uM，各取5ul变性梯度退火
然后1/10, 1/100,1/1000三个梯度稀释，直接取1ul做连接
根本不用纯化。 注意oligo浓度高了会抑制连接。 |
w*******d
发帖数: 396 | 10 right.
【在 a*******a 的大作中提到】
: 加磷干啥，浪费钱。载体是切开的两头就有磷了
: 合成的oligo加不加无所谓的。
: 最简单粗暴的方法
: 两条sequence，反向互补， 末端带粘性末端
: 干粉稀释成100uM，各取5ul变性梯度退火
: 然后1/10, 1/100,1/1000三个梯度稀释，直接取1ul做连接
: 根本不用纯化。 注意oligo浓度高了会抑制连接。
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