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发帖数: 233 | 1 夏荣辉，李江
上海交通大学医学院，上海（200011）
E-mail：e******[email protected]
摘 要：基因的表观遗传学修饰正越来越受到人们的重视，它包括DNA甲基化和组蛋白修
饰，组蛋白修
饰又包括组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化。基因的表观遗传学改变在基因转录调节方面有
重要作用。最
近研究较多的是多种组蛋白修饰方式和DNA甲基化在基因转录调节方面的共同作用，本
文详述组蛋白
修饰和DNA甲基化的发生机制，并且总结了组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化与DNA甲基化之
间的相互作
用，提示不同位点的组蛋白甲基化与DNA甲基化共同作用于基因转录，并且发挥不同的
作用，具体体
现在组蛋白乙酰化、组蛋白H3K9、H3K27和H4K20甲基化与DNA甲基化协同作用，使基因
发生转录抑
制，而组蛋白H3K4甲基化与基因转录激活有关。
关键词：组蛋白修饰；DNA甲基化；关系
1. 引 言
目前，在研究肿瘤发生发展的过程中，基因的表观遗传学修饰所起的作用日益得到人们
的重视。组蛋
白修饰和DNA甲基化是两种最重要的表观遗传学修饰方式。研究表明，人类几乎所有类
型的肿瘤都存
在组蛋白及DNA甲基化的异常，并且二者存在一定程度的关联，这些异常可以引起抑癌
基因的沉默
[1]。表观遗传学改变在胃癌、肺癌和前列腺癌等研究中涉及较多，但是，最近在头颈
部肿瘤和口腔
恶性肿瘤的发生、发展机制的研究中，表观遗传学改变所起的作用也越来越受到重视。
因此，了解二
者之间的关系对头颈部肿瘤和口腔恶性肿
瘤的诊断、治疗和预后有重要意义。
2. 组蛋白修饰
染色质的基本单位为核小体，核小体中部是由四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各两个分
子构成的八
聚体核心，N端尾部为单一的H1。组蛋白可以共价修饰而发生乙酰化、甲基化、磷酸化
、泛素化和多
聚二磷酸腺苷糖基化等[2]，由此构成多种多样的组蛋白密码。
乙酰化的组蛋白与DNA的结合能力减弱，从而使染色质构象处于开放状态，有利于基因
的转录和表
达。组蛋白乙酰化是一可逆过程，由组蛋白乙酰化转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)
调控。乙酰
化转移酶家族可作为辅激活因子调控转录、调节细胞周期、参与DNA损伤修复，还可作
为DNA结合蛋
白。去乙酰化酶家族则和染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周期、细胞分化和增
殖以及细胞凋
亡相关[3]。
组蛋白甲基化由组蛋白甲基化转移酶(histone methyltransferases，HMT)催化，其作
用位点
主要在精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)的侧链N末端上，组蛋白甲基化在异染色质的形成、X
染色体的失
活、基因组印迹、DNA修复及基因转录调控中有重要作用。
3. DNA 甲基化
DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化，将活性甲基从S
-腺苷
蛋氨酸转移至胞嘧啶的C5位上，形成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在哺乳动物细胞基
因组中约3%
一5%的胞嘧啶被甲基化，其中约70%一80%的5-甲基胞嘧啶存在于CpG二核苷酸序列中，
而CpG序列
相对集中的区域称为CpG岛。在生理情况下，除定位于失活X染色体上的基因和印记基因
外，正常的
CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。这些CpG岛跨过许多基因的5’末端——包括启
动子、未翻译区
和第一外显子，而这些基因通常是管家基因和组织表达特异性基因。
大量研究结果显示，全基因组的低甲基化是肿瘤细胞的基本特征之一。但是也伴有某些
特定CpG岛甲
基化程度的增高。低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因的印迹缺失以及增
加染色体的不
稳定性，最终诱发肿瘤；同时，在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因启动子区多发
生高甲基化，
导致基因沉默，这是由于其高甲基化使DNA发生转录抑制。
现代肿瘤理论认为，甲基化修饰是继基因结构变异即突变和缺失之后的第三种抑癌基因
失活机制。
4. 组蛋白修饰和 DNA 甲基化关系
4.1 组蛋白去乙酰化与DNA 甲基化之间的关系
组蛋白去乙酰化与DNA甲基化之间的关系研究比较明确，Cervoni等[4]利用哺乳动物细
胞瞬时转
染，结果表明组蛋白去乙酰化可能指导DNA甲基化，并且组蛋白去乙酰基酶抑制剂
TSA(trichostation A)能引起脉孢菌Neurospora 特异的胞嘧啶超低甲基化，并损害哺
乳动物
rRNA编码基因的CpG甲基化[5]。还有研究发现，DNA甲基化会影响组蛋白修饰模式，DNA
甲基化系统如DNA甲基转移酶(DNMTs)甲基化DNA结合蛋白(MeCPs)可募集包含组蛋白去乙
酰基
(HDACs)在内的阻遏复合物[6]。DNA甲基化的CpG二核苷酸可被甲基结合蛋白家族(MBD)
所识别，
MBD招募组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、组蛋白甲基转移酶(HMT)和ATP依赖的染色质重塑，
三者共同作
用，改变染色质结构和活性，以间接方式影响其基因转录。可见DNA甲基化、组蛋白去
乙酰化和组蛋
白甲基化之间有着密切关系。
关于组蛋白去乙酰化与DNA甲基化的具体关系，Jiejun Wu等[7]在对小鼠白血病细胞系L
-1210中
组蛋白修饰和DNA甲基化关系研究过程中发现，组蛋白乙酰化在激活基因转录方面有明
显作用，这与
DNA甲基化的使基因沉默的作用是相反的。而HDACs可使组蛋白的乙酰-Lys残基或转录因
子如p53去
乙酰化，使DNA结合蛋白产生直接的局限性转录抑制[8]，组蛋白去乙酰化和DNA甲基化
在基因沉默方
面具有协同作用。
DNA甲基化在头颈部肿瘤和口腔恶性肿瘤中研究较多，最近研究表明，在口腔鳞状细胞
癌中，启动子
区的甲基化是抑癌基因TSC基因表达下调的重要机制之一[9]。Munehiro Kishi等[10]对
36例涎
腺恶性肿瘤进行了研究，发现与周围正常组织乙酰化水平相比，有约16.7%和13.9%的肿
瘤细胞出现
了组蛋白H3和H4的低乙酰化，并且与RB1、p21、p27、PTEN和p53等基因的甲基化相关，
但是它们
之间的相关作用还有待进一步研究。
4.2 组蛋白甲基化与DNA 甲基化之间的关系
组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化，赖氨酸
可以是单甲基
化、双甲基化和三甲基化，精氨酸也可以是单甲基化和双甲基化，这些不同状态的甲基
化组合更为复
杂，能让组蛋白甲基化发挥更大的调控作用。以往认为组蛋白甲基化是稳定的表观遗传
标志，然而，
继在果蝇中发现第一个组蛋白赖氨酸甲基转移酶Su(var)3-9蛋白后，Shi等[11] 首次发
现了去甲
基化酶，即赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)，此酶作用
于H3 lysine 4(K4)位点，但是奇怪的是这个酶并不属于任何一个家族，并且只针对
H3K4位点的
甲基化发生作用。虽然该酶的作用还有待进一步研究，但是组蛋白去甲基化酶的发现，
使组蛋白甲基
化成为一个动态过程。
4.2.1 H3 lysine 9(K9)甲基化与DNA 甲基化之间的关系
在哺乳动物中，DNA甲基转移酶和Suv39h酶(哺乳动物中第一个被发现的组蛋白甲基化转
移酶)相互
作用。在缺失Suv39h基因的小鼠胚胎干细胞中，H3K9甲基化的水平降低,并且依赖
DNMT3b的CpG二
核苷酸甲基化程度也明显降[12]。另外，Bachman等[13] 发现H3K9甲基化和p16ink4a肿
瘤抑制
基因的沉默发生在CpG甲基化之前，因此，DNA的甲基化可能依赖于H3K9的甲基化，DNA
甲基化在组
蛋白赖氨酸甲基化事件的下游起作用。不过，对于H3K9
甲基化和DNA甲基化发生的先后顺序，却仍存在争议，Wim J.J.Soppe等[14]的研究表明
DNA甲基
化先于H3K9甲基化和异染色质的凝结。这两个事件发生的先后顺序还有待进步一步研究
，但是对真
菌、植物、和哺乳动物的研究表明，H3K9甲基化和DNA甲基化之间的相互作用存在进化
保守性
[15,16]，这也证明了H3K9在基因沉默方面与DNA甲基化有协同作用。
有趣的是，Jian Hou等[17]在对绵羊受精卵的研究中发现H3K9甲基化与DNA甲基化并没
有密切关
系。Jiejun Wu等在对小鼠白血病细胞系L-1210中组蛋白修饰和DNA甲基化关系研究过程
中也发
现，H3K9甲基化在基因沉默方面的作用并非之前研究的那么明显，其可能的机制是，
H3K9甲基化最
主要作用靶标并不是编码蛋白基因的启动子区，其对基因的调控作用，尤其是与DNA甲
基化之间的相
互作用，也因染色体上定位不同而异。
4.2.2 H3 lysine 27(K27)甲基化与DNA 甲基化之间的关系
H3K27是一个转录抑制的表观遗传学标记。在对参与H3K27甲基化定位的一种蛋白质复合体
PcG(Polycomb group)protein Eed突变小鼠研究时发现，Eed在常染色体印迹基因座内
某些基
因的沉默是必需的，在这些小鼠基因座中父系等位基因的去阻遏可能和差异甲基化区
CpG去甲基化有
关[18]。而在Yoko Yamasaki-Ishizaki等的研究中也发现，受Eed调节的H3K27
甲基化与DNA甲基化协同作用，导致基因沉默。最近M. Luz Martínez-Chantar等[19]
对甘氨酸
甲基转移酶基因敲除小鼠研究时发现，小鼠肝肿瘤细胞中RASSF1和SOCS2基因的启动子
区出现高甲
基化，同时，与启动子区结合的三甲基化的H3K27的量大约是正常小鼠的两倍。
虽然这些研究表明H3K27甲基化和DNA甲基化有密切的关系，但是Xiaoyu Zhang等[20]对
拟南芥
（Arabidopsis）的研究中却发现H3K27三甲基化独立于其他的表观遗传修饰方式，尤其
是与DNA
甲基化并没有相互作用关系。还有研究指出，DNA甲基化与H3K27甲基化有拮抗作用，三
甲基化的
H3K27能够侵入未发生甲基化的位点，而DNA甲基化则可以排斥正常位点的H3K27的三甲
基化[21]。
因此，它们二者之间的联系还有待进一步研究。
4.2.3 H4 lysine 20(K20)甲基化与DNA 甲基化之间的关系
H3不是唯一发生赖氨酸残基甲基化的组蛋白，组蛋白H4中的第20位赖氨酸也可发生甲基
化，H4K20
与H3K9和H3K27的甲基化方式相似，Gunnar Schotta等首次发现了Suv4-20h酶，该酶是
H4K20
甲基化转移酶，此酶的降解不会对同一位点的DNA甲基化造成影响，但是却会影响H3K9
三甲基化
[22]，进一步研究表明H4K20与基因的沉默状态有关，并且H4K20和H3K9三甲基化组成的
复合物在
抑制基因转录方面可能有更为重要的作用。另外，Fraga等[23]的研究表明，某些肿瘤
细胞组成性异
染色质中缺少H4K20三甲基化，对H4K20甲基化缺失区域进行进一步研究发现，这些区域
出现DNA超
低甲基化。因此，H4K20三甲基化不仅和H3K9协同作用，而且与DNA甲基化也有有密切的
联系，它们
的协同作用将使得基因沉默。
4.2.4 H3 lysine 4(K4)甲基化与DNA 甲基化之间的关系
甲基化H3K4常出现在具有转录活性的染色质中，在对酵母和黑腹果蝇的研究中发现，组
蛋白H3K4甲
基化水平在基因激活位点明显升高[24,25]。Cindy Yen Okitsu等[26]的研究证实在其
他转录条
件满足的情况下，H3K4二甲基化将会打开染色质结构便于转录的开始，并且发现DNA甲
基化与该区域
的H3K4甲基化缺失有密切关系，这可能是静默基因的一种自我保护机制，即发生DNA甲
基化的区域不
会存在H3K4的甲基化，这使得两种相互冲突的修饰方式不会同时出现。Cindy Yen
Okitsu等在对
pMeLuc 和 pMe5_Luc基因的研究中还发现，DNA甲基化并不影响该区域下游200碱基对(
bp)之外
的未甲基化的启动子区域的H3K4二甲基化，即在距离DNA甲基化200bp以外区域仍可检测
到H3K4甲
基化的存在由此可知，DNA甲基化直接影响H3K4二甲基化的存在。因此，H3K4甲基化的
主要作用可
能与DNA甲基化作用有着相反的效果，其主要作用于基因的激活。
4.2.5 其他
组蛋白甲基化除了赖氨酸甲基化之外，精氨酸也可以发生甲基化。组蛋白精氨酸甲基转
移酶作为协同
激活因子被募集到目标基因的启动子区，这种酶属于组蛋白甲基转移酶中的CARMI和
PRMT1家族，这
两个家族中的酶分别对H3和H4组蛋白起转甲基作用[27] ，精氨酸甲基化对基因表达有
激活作用。
组蛋白修饰除了乙酰化和甲基化以外，还有磷酸化、泛素化和多聚二磷酸腺苷糖基化，
以及最近研究
较多的Sumo化(small ubiquitin-like modifier)修饰，作为组蛋白修饰的一种新方式
，它参
与基因沉默和DNA损伤的修复。但这几种形式的修饰和DNA甲基化之间的关系研究还较少
，与DNA甲基
化之间的相互作用仍不明确。
在上述这些研究中，组蛋白甲基化主要是针对小鼠、果蝇和酵母等，而在其他肿瘤方面
，尤其是头颈
部肿瘤和口腔恶性肿瘤的研究中则鲜有涉及，因此，组蛋白甲基化与DNA甲基化之间的
联系在这些肿
瘤中的作用并不清楚，这也是值得我们深入研究的地方。
5. 小结
综上所述，组蛋白去乙酰化、H3K9、H3K27、和H4K20 甲基化通常与DNA 甲基化一起在
基因转录
抑制方面起作用，而H3K4 甲基化主要使基因转录激活，然而它们之间的相互作用仍有
一些不明确的
地方。组蛋白修饰和DNA 甲基化是最重要的两种表观遗传修饰方式，它们之间的相互作
用关系值得我
们深入研究，并且找出它们之间的确切联系，这对我们明确肿瘤的发生发展，更好地进
行诊断和治疗
有着重要的意义。 | g*********d
发帖数: 233 | 2 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰, 这些修
饰构成了丰富的“组蛋白密码”(Histone code), 能影响染色质的压缩松紧程度,因此
在基因表达中起重要的调节作用[10, 11]。其中甲基化是组蛋白重要的修饰方式, 多发
生于组蛋白H3、H4 的赖氨酸(K)和精氨酸(A)残基上, 组蛋白赖氨酸甲基化既可以导致
激活, 也可以导致抑制, 通常取决于它所位于的残基情况。如H3K9、H3K27和H4K20 甲
基化一般与异染色质形成有关, 是学者们熟知的重要的“失活”标记物(Hallmark), 而
“活性”标记物则包括H3K4 及H3K36 的甲基化[12~15]。
乙酰化也是组蛋白重要的修饰方式, 多发生于N-末端保守的赖氨酸残基上, 如组蛋白H3
上的9号和14号赖氨酸残基, H4上的5号、8 号、12号和16号赖氨酸残基, 组蛋白H3和H4
上赖氨酸的乙酰化与活化或开放的染色质有关。与此相反, 赖氨酸残基经脱乙酰作用
导致染色质压缩和基因的失活[11]。不同的组蛋白修饰之间可以相互影响, 并与DNA 甲
基化相互作用[11, 16,17]。
非编码 RNA( Non-coding RNAs) 是指不能翻译为蛋白的功能性RNA 分子, 分为看家非
编码RNA(Housekeeping non-coding RNA)和调控非编码RNA(Regulatory non-coding
RNA), 其中具有调控作用的非编码RNA按其大小主要分为两类]18, 19]: 短链非编码RNA
(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)(表1)。
尽管近年来大量研究表明非编码RNA 在表观遗传学修饰中扮演了重要的角色, 能在基因
组水平及染色体水平对基因表达进行调控, 决定细胞分化的命运[20~25](图1), 但相对
于其他生物(酵母、果蝇、线虫及植物等), 哺乳动物细胞中表观遗传学的研究相对滞后
。本文将重点综述上述４种非编码RNA 在哺乳动物细胞中对表观遗传学的调控作用。
图1 非编码RNA 在表观遗传学中的作用
1 siRNA
siRNA 来源于长的双链RNA 分子(包括RNA 病毒复制子、转座子或转基因靶点等), 经
Dicer 酶剪切为21~25 nt 的双链RNA 片段, 装载至AGO 蛋白
而发挥作用[26, 27](图2a)。
近年研究表明, siRNA 能在哺乳动物细胞中介导DNA 甲基化和组蛋白修饰, 从而导致转
录基因沉默(Transcriptional gene silencing, TGS)[28~32]。Kawasaki等[30]首先合
成了靶向CpG 岛E-cadherin 基因启动子的siRNA, 通过亚硫酸氢盐修饰结合测序法(
Bisulphite sequencing)证实, 同源siRNA 转染的细胞(人乳腺癌细胞MCF-7 和人正常
乳腺细胞), 其靶标DNA 发生了特异性的甲基化及组蛋白H3K9 的甲
基化, 而且该沉默依赖于DNMT1/DNMT3b, 提示基因沉默发生于转录水平, 是由DNA 甲基
化引起的。Morris 等[31]研究结果表明靶向延长因子1α
(Elongation factor 1alpha, EF1A) 启动子的siRNA能够导致TGS, 其机制与靶标的DNA
甲基化密切相关, 进一步证实了哺乳动物细胞内siRNA 介导的TGS 的保守性。
但有实验报道[33]:
TGS 过程中并未发生DNA 甲基化, 提示DNA 甲基化并非参与所有小RNA 介导的TGS, 或
者是DNA 甲基化在暴露于小RNA 的过程中发生了变化。最近Morris 实验室[34]的研究
结果表明: 以siRNA 持续作用于人泛素C(Uboquitin C,UbC)基因启动子至少3 d, 可导
致长期的基因沉默,靶标首先发生组蛋白甲基化, 随后是DNA 的甲基化,即靶标DNA 甲基
化的检出明显迟于组蛋白修饰, 这在一定程度上可以解释并非所有的siRNA 介导的TGS
中都能检测到DNA 的甲基化。同时提示, 相对于组蛋白修饰而言, 启动子的DNA 甲基化
是一个更容易遗传、更长久的沉默, 即DNA 甲基化主要在维持长期的基因沉默方面起作
用[35]。
为探讨哺乳动物细胞内siRNA 介导的TGS 机制, Morris 等[36, 37]进一步研究了靶标
启动子的组蛋白甲基化、转录的依赖性以及siRNA 的双链是否均参与了TGS, 实验结果
表明siRNA 能引起靶标启动子EF1A 区域H3K9 和H3K27 的甲基化, 而且靶向启动子的
siRNA 中, 只有其21 bp 的反义RNA 链—— 引导链(Guide strain) 对于TGS 是必需的
, 且其主动转录需要RNA 多聚酶II(RNA polymerase II, RNAPII)的参与。
目前研究表明: Argonautes 蛋白家族 (AGO1 及AGO2), DNMT3a, 组蛋白去乙酰化酶(
Histone deacetylase-1, HDAC-1)和/或Polycomb 蛋白家族(Polycomb group, PcG)的
EZH2 (Enhancer of zeste
homolog 2)参与了siRNA 诱导的TGS [30, 37~39]。
哺乳动物细胞内有4 种AGO, 其中主要是AGO1及AGO2 参与TGS, AGO1 虽然与AGO2 的同
源性为80%, 但它缺乏一个关键的催化酶, 不能有效地
裂解RNA, 因此对于AGO1 及AGO2 的选择可能依赖于小RNA 与靶标之间的互补性[38]。
通常完全互补的dsRNA 前体诱导的染色质重塑是由AGO2 引发,而发卡状的dsRNA 前体诱
导的染色质重塑是由AGO1 引发[40]。有意义的是, AGO 在TGS 中的作用早于靶标启动
子的组蛋白甲基化, 当靶标沉默态组蛋白修饰( H3K9 甲基化)增加时, AGO-1 明显减少
,证明AGO1 及 RNAPII 对H3K9 的双甲基化是必需的[37]。
EZH2 作为组蛋白甲基转移酶, 在一定程度上能够引起H3K27 的甲基化, 而甲基化的
H3K27 作为锚点可募集多余的PcG, 从而参与沉默态染色质的形成, 导致TGS[39]。染色
体免疫沉淀结果表明:
DNMTs 与EZH2 抑制的基因之间的结合依赖于EZH2 的存在; 亚硫酸氢盐修饰结合直接测
序结果也证明EZH2 对于其靶向的启动子甲基化是必需的,
提示EZH2 作为募集DNA 甲基转移酶的平台, 参与了DNA 的甲基化。研究报道, 在某些
基因的靶标启动子内DNMT3a 能与小RNA发生免疫共沉淀, 表明
DNMT3a 也参与了靶标启动子的TGS[36]。
总之, TGS 的建立与维持需要多种不同的蛋白:
通常AGO1、DNMT3a 及HDAC-1 对于起始的沉默是必需的, 而DNMT1 对于维持沉默是必需
的[34]。
已知 RNAPII 参与了小RNA 介导的TGS, 研究报道RNAPII 与AGO1 免疫共沉淀于启动子
区域, 但尚不清楚RNAPII 是如何发挥作用的。目前研究主
要集中为两种模型。
第一种为RNA-RNA 模型(图3A):
其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。近来更
多的研究支持这一模型, 其中一个关键的实验是应用对siRNA 敏感的INK4/ARF 位点的
调节域(Regulatory domain, RD)作为实验平台, 研究siRNA 介导的RD染色质重塑, 结
果显示其重叠转录是靶向转录链而非模板链, 而且完全互补的双链RNA 前体及不完全互
补的双链RNA 前体均可介导异染色质的形成[41]。
另有研究结果表明经RNAPII 合成的低拷贝转录子,可被siRNA 的引导链识别, 并作为识
别域引导沉默复合物至启动子区域导致TGS[29]。以互补的硫代磷酸酯寡核苷酸 (
Phosphorothioate oligonucleotides,
PS-ODNs) 封闭这些低拷贝转录子, 可终止siRNA靶向的启动子沉默。
第二种为RNA-DNA 模型(图3B): 其主要特征是在转录过程中, RNA 引导链与靶标的一条
DNA 形成二聚体, 从而导致沉默。支持该模型的直接证据包括: RNAPII 能与TATAA 转
录起始点上游松解的核小体结合, 从而参与TGS[42], 以及DNMT3b 直接参与了siRNA 介
导的TGS[30]。事实上, 这两种模型并非相互排斥, 可能是siRNA 参与了不同的功能过
程, 当siRNA 直接靶向TATAA或RNPII 结合位点时, 以RNA-DNA 方式介导TGS,
而大多数情况下siRNA 是以RNA-RNA 方式发挥作用。
图 3 RNA 基因沉默的作用模式(人细胞)[35]
A: RNA/RNA 模型:
RNA 引导链与RISC(AGO1、Ezh2、DNMT3a 或HDAC-1)结合, 随后与RNAPII 合成的低拷贝
转录子结合, 从而介导TGS。
B: RNA/DNA 模型:
RNA 引导链与RISC(AGO1、Ezh2、DNMT3a或HDAC-1)定位于基因组DNA, 随后与靶标的一
条DNA 形成二聚体, 从而介导TGS。
2 miRNA
miRNA 是长约21～25 nt 的单链RNA, 其中50%定位于易发生结构改变的染色体区域[43]
。最初认为miRNA 和siRNA 的区别主要有两点: (1) miRNA 是内源性的, 是生物体基因
的表达产物; siRNA 是外源性的, 来源于病毒感染、转座子或转基因靶点。(2)
miRNA 是由不完整的发卡状双链RNA, 经Drosha和Dicer 酶加工而成; siRNA 是由完全
互补的长双链RNA, 经Dicer 酶剪切而成[44](图2b)。尽管如此区别,由于miRNA与siRNA
密切相关, 如两者片段大小相近, 均经Dicer 加工后装载至AGO 蛋白而发挥作用,因此
推测miRNA 也能介导TGS, 而且两者的作用机制有所重叠[22, 27, 40]。
目前研究表明: 哺乳动物细胞内miRNA的调控机制反映了miRNA 的特异装载蛋白AGO 以
及miRNA 与mRNA 之间的互补程度[45]。通常只有极少数的 miRNA 与其mRNA 靶标几乎
完全互补, 从而可以经内切酶直接裂解mRNA, 而绝大多数miRNA 与其mRNA 靶标只有部
分互补, 一般为6~7个碱基, 位于mRNA 的5′端的第2~7 位核苷酸, 称为“种子区” (
Seed region), 在与靶标的结合中起重要作用, 因此种子区是筛选靶标的最基本的特异
性的决定因素, 同时不少研究提示一个miRNA 可调控许多甚至上百个不同的基因[45~48
]。 Lewis 等[48]通过对13 000 多个人类基因的研究进一步推测: 组蛋白甲基化酶、
甲基化CpG 结合蛋白、染色质域蛋白及组蛋白去乙酰化酶等均是miRNA 潜在的作用靶标。
已有研究表明miRNA 可通过调控组蛋白修饰引起染色质重塑。有学者报道组蛋白去乙酰
化酶4(HDAC4)是鼠胚胎软骨组织特异的miR-140 的靶标, 提示miRNA 可通过调控组蛋白
的修饰而参与TGS[49]。Kim 等[50]研究发现: 哺乳动物细胞基因组保守的miRNA 之一
—— miR-320(由细胞周期基因POLR3D 启动子上游编码)能引导AGO1 至POLR3D启动子,
同时还有EZH2 及H3K27 三甲基化的参与,以顺式方式诱导TGS, 这进一步证实miRNA可在
哺乳动物细胞内引起TGS。
近来的研究进一步证明miRNA 可通过调控DNA 甲基化酶的表达而影响DNA 甲基化。
Fabbri等[51]研究发现在非小细胞癌内, miR-29 家族(包括
miR-29a、miR-29b 和miR-29c)的表达是下调的, 而DNMT3a、DNMT3b 处于高表达状态,
miR-29 家族与DNMT3a、DNMT3b 的3′UTR 端的互补性提示DNMT 的mRNAs 是miR-29 家
族的作用靶点。
Benetti 等[52]及Sinkkonen 等[53]的研究均表明Dicer缺失鼠胚胎干细胞内, DNMT3a
、DNMT3b 表达的下调是依赖于miR-29 家族, 其主要机制是: Dicer 酶的缺失使miR-29
家族表达下调, 而miR-29 家族可抑
制视网膜母细胞瘤样蛋白2(Retinoblastoma-likeprotein 2, Rbl2) 的表达, 后者通过
抑制DNMT3a、DNMT3b 的活性, 使DNA 甲基化缺失, 同时提示miR-29 通过增强抑癌基因
的表达而抑制肿瘤的发生。Gonzalez 等[41]研究结果显示: 哺乳动物细胞的肿瘤miRNA
—miR17-5p 及miR20a 能在具有重叠转录功能并与miRNA 种子区互补的启动子区域诱导
异染色质的形成, 进一步揭示了miRNA 调控的染色质重塑和基因转录的新机制。上述研
究将有助于我们更加全面真实地阐明肿瘤的发生机制, 为寻找肿瘤治疗的新靶点提供一
个全新的视野。
3 piRNA
piRNA 是近年来在哺乳动物细胞内发现的长度约为24～31 nt 的RNA 分子, 因在生理状
态下能与Piwi 蛋白偶联, 故命名为piRNA(Piwi interacting RNA, piRNA)[54~56]。由
于Piwi 为一表观遗传学调控
因子, 能与PcG 蛋白共同结合于基因组PcG 应答元件上, 协助PcG 沉默同源异型基因,
因此推测与Piwi相关的piRNA 也应具有表观遗传学的调控作用[57]。
研究表明哺乳动物细胞piRNA 分为两个亚簇[7~9, 58, 59]: 一是粗线期piRNA簇: 主要
出现于减数分裂的粗线期, 持续表达至单倍体精子细胞阶段,
一般很少有重复片段; 二是粗线前期piRNA 簇: 主要出现于减数分裂前的生殖细胞, 虽
然具有粗线期piRNA 簇的分子特征, 但来源于一个完全不同的簇,与果蝇及斑马鱼的
piRNA 相似, 具有重复片段。大多数piRNA 的5′端有单磷酸化基团而且偏爱尿嘧啶碱
基(> 84%), 3′端有2′O –甲基修饰, 其生物学意义仍不清楚, 推测可能对piRNA 的
稳定性及功能至关重要。
目前 piRNA 的生物合成和作用机制尚不清楚。鉴于piRNA 的作用不依赖于Dicer 酶,
哺乳动物细胞粗线期piRNA 簇具有明显的链不对称性, 提示
piRNA 来源于单链前体, 而非双链分子[60, 61]。因此产生两种假说: 一是piRNA 由长
单链分子产生; 二是piRNA 可能为初级转录产物。Aravin 等[59]通过鼠细胞内的实验
证据提出哺乳动物细胞piRNA 的自我扩增模型, 与果蝇扩增模型不同的是: 基因簇并非
初级piRNA 的主要来源, 而是由转座子mRNA 产生初级正义piRNA 参与扩增循环(图2c)。
已有研究表明DNA 甲基酶家族(DNMT3a、DNMT3b 及DNMT3L)在转座子甲基化的形成中起
主要作用, 其中DNMT3a 和DNMT3b 的催化活性在
生殖细胞及体细胞内均非常重要, DNMT3L 则是生殖细胞内甲基化形成的一个核心调控
子[6, 62]。实验发现鼠的MILI 和MIWI2 蛋白对于其睾丸中
LINE-1 和IAP 转座子成分的沉默是必需的, MILI 或MIWI2 的缺失可以使转座子甲基化
标识丢失, 而且突变鼠的表型与DNMT3L 缺失鼠的表型一致; 在甲基化形成的关键时期,
MIWI2 始终定位于细胞核内;
小RNA 序列分析显示MILI 和MIWI2 均作用于DNMT3L 的上游, 随后作用于DNMT3a 和
DNMT3b的上游。上述实验结果证实Piwi/piRNA 复合体能介
导转座子甲基化的形成, 且Piwi 途径位于DNA 甲基化调节因子的上游, piRNA 是生殖
细胞内DNA 甲基化的特异性决定子[63~65]。目前在果蝇中的研究已表明Piwi 能通过直
接募集染色质结构域蛋白HP1a而参与异染色质的形成(H3K9 甲基化), 但在哺乳动物细
胞内尚无类似研究报道[66]。
4 lncRNA
lncRNA一般是指大于200nt 的RNA, 不参与或很少参与蛋白编码功能, 位于细胞核内或
胞浆内[67, 68]。
通常分为5 类: 即正义(Sense)、反义(Antisense)、双向(Bidirectional)、基因内(
Intronic)及基因间(Intergenic)
lncRNA[18]。
lncRNA 有多种不同的来源, 目前认为可能是[18]
(1)编码蛋白的基因结构中断而转变为lncRNA;
(2) 染色质重组的结果, 即两个未转录的基因与另一个独立的基因并列而产生含多个外
显子的lncRNA;
(3) 由非编码基因复制过程中的反移位产生;
(4)由局部的串联复制子产生邻近的非编码RNA;
(5)基因中插入一个转座成分而产生有功能的非编码RNA。尽管众多的lncRNA 没有共同
的起源, 但研究表明它们在基因表达的调控方面起着相似的作用[68]。
哺乳动物细胞内lncRNA 调控的表观遗传学研究, 最早源于基因组印记(Genomic
imprinting) 和X染色体失活(X chromosome inactive), 分别与H19 和Xist RNA 密切
相关[69, 70]。H19 作为基因组印记的、母
源表达的lncRNA, 经过剪接及多聚腺苷酸化后输送至胞浆内, 并可累计达到较高浓度。
虽然H19 是第一个发现的与基因组印记密切相关的基因, 但H19
的功能至今尚不明确。近来有学者在人和鼠细胞中发现H19 RNA 是 miR-675 的前体[71
], 提示H19 RNA可能通过miRNA 发挥基因调控作用。基因组印记除了与H19 基因簇有关
, 还有Kcnq1ot1、Air 及 Nespas
基因的参与, 它们通常是父源表达的, 通过卵母细胞中启动子的DNA 甲基化抑制母系等
位基因的表达[72~74]。Kcnq1ot1 和 Air 启动子的缺失实验结果表明, lncRNA 或其转
录产物分别对于Kcnq1ot1 和lgf2r/Air 印记基因簇的沉默是必需的, 而且对长达800bp
的印记基因簇抑制性组蛋白标记(H3K27 三甲基化和 H3K9 双甲基化)以及某些基因的
DNA甲基化
也是必需的[74, 75]。
Xist RNA(17 kb 长的非编码RNA)对于哺乳动物细胞内X 染色体失活非常重要, 但Xist
并不输送至胞浆, 而是与即将被它失活的X 染色体的某个RNA结构域或成分相连, 在失
活染色体表面形成“外套”(Coating)并以顺式方式介导基因沉默[70, 76]。目前认为
Xist RNA 在没有Pol II 的情况下, 建立了一个特别的核区, 大多数即将被失活的染色
体在此定位并失活, 其基因沉默特征是失去激活性的组蛋白修饰(如乙酰化)而获得抑制
性的组蛋白修饰(如H3K27的三甲基化), 最后, 失活染色体上的许多CpG 岛启
动子甲基化[77]。近来Zhao 等[78]研究表明: RepA(Xist RNA 上的一个1.6 kb 片段),
能通过募集Polycomb 抑制复合物2( Polycomb repressive complex 2, PRC2)并通过
EZH2 靶向将被失活的染色体, 使染色体H3K27 发生三甲基化, RepA 缺失实验表明RepA
对完整的Xist RNA 及H3K27 的甲基化是非常重要的。
有意义的是, 即使在细胞分裂中期, 该“外套”始终以顺式方式与失活的染色体相连,
经多次细胞分裂后, X 染色体失活始终存在[79], 表明RNA“外
套”与组蛋白修饰及DNA 甲基化共同构成表观遗传学的记忆, 从而使失活的染色体进行
有丝分裂。但在体细胞, Xist 基因的缺失并不影响基因沉默, 提示一旦建立了记忆,
lncRNA 诱导的沉默结构域是非必需的。
近来研究表明X 染色体失活和基因组印记可能共享一些基因簇, 其基因沉默的机制不仅
包括顺式作用, 还有反式作用。例如HOX 转录反义RNA (Hox
transcript antisense RNA, HOTAIR), 它来源于HOXC位点, 能以反式方式沉默HOXD 位
点长达40 kb 的基因转录, 主要机制是通过HOTAIR 募集PRC2 至HOXD 位点, 使X 染色
体和Kcnq1 域分别发生H3K9三甲基化, 从而引发异染色质的形成及TGS[80]。
另有研究报道[81]: X 染色体失活尚存在另一机制, 即Xist 和Tsix 复性形成RNA 二聚
体, 经Dicer酶剪切成为小干扰RNA, 其对于失活的X 染色体
上异染色质的修饰是必需的。这两个不同的途径或许可以协调 lncRNA 和小RNA 在染色
质重塑方面的作用, 同时提示RNA 调控存在着一个更为复杂的、交互的网络。
5 结语与展望
随着对非编码RNA 在哺乳动物进化及疾病发生发展中作用的关注, 非编码RNA 作为表观
遗传学调控的新机制, 已成为现代遗传学研究的热点问
题。然而, 迄今为止, 人们对于哺乳动物细胞内非编码RNA 调控机制的了解还十分有限。
最初认为 siRNA、miRNA 及piRNA 的作用途径是独立的, 而且有明显的区别。但近年来
研究报道这些作用途径的界限已开始模糊, 其中有些作用子之间有交互作用, 从而构成
了一个调控网络。那么生物体是如何适应这些多重的调控机制？在解决这个问题之前,
我们必须先弄清楚非编码RNA 本身的详细信息。目前一个关键问题是已有的实验证据仅
代表了庞大的复杂的RNA 调控网络的一个侧面,还是仅对最初的基于蛋白调控机制的补
充？解析这一调控网络和/或单一的非编码RNA 的工作非常艰巨, 需要系统地研究和发
现并分析非编码RNA, 逐步完善并应用全基因扫描技术揭示非编码RNA 表达的全部信息
及功能, 最终目标是阐明哺乳动物细胞内非编码RNA 调控的表观遗传学的详尽机制, 以
及它们在正常细胞以及疾病状态下的交互作用。
目前已知哺乳动物细胞内AGO 是siRNA 和miRNA 的装载蛋白, Piwi 是piRNA 的偶联蛋
白,AGO 和Piwi 蛋白及小RNA 均参与了染色质或DNA
修饰而介导TGS, 但尚不清楚它们是如何靶向其特异的染色质区域以及如何募集修饰酶
？虽然与TGS密切相关的染色质结构域蛋白HP1 在进化过程中
(包括酵母、果蝇及哺乳动物细胞)高度保守, 在酵母及果蝇中的研究亦表明HP1 的同源
物(Swi6 和Chp2)及CD 域结合蛋白Chp1, 均能与甲基化的H3K9 结合并参与TGS, 但在哺
乳动物细胞尚无直接的实验证据。对这些未知的染色质接头蛋白进行生物化学和细胞生
物学分析, 不仅有助于揭示小RNA 对表观遗传学的调控机制, 而且将为临床基因治疗提
供新的有效的靶点。
另一个重要问题是关于piRNA 的生物起源及其生物学功能, 根据目前实验证据提出的
piRNA 自我扩增模型固然成立[27, 59], 但低估了生物合成机制的复杂性。如piRNA 的
3′端修饰是如何产生的？piRNA自我扩增循环是如何调控的？哺乳动物细胞piRNA不同
于果蝇和斑马鱼的piRNA, 只有17%~20%的piRNA 分布于重复序列, 包括转座子和反转座
子,提示可能有其他因子参与piRNA 介导的基因沉默。有必要对这些位点进行遗传学分
析并进一步研究清楚piRNA-Piwi 复合物中的蛋白组分, 从而有助于阐明piRNA 的生物
学功能。今后对piRNA 的生物起源及多种潜在的功能研究, 必将促进我们对piRNA 在哺
乳动物细胞内调控机制的理解。
========================
表1 表观遗传学中起主要调控作用的非编码RNA
种类 长度(nt) 来源主要功能
siRNA ~21~25 长双链RNA 转录基因沉默
miRNA ~21~25 含发卡结构的pri-miRNA 转录基因沉默
piRNA ~24~31 长单链前体或起始转录产物等多途径生殖细胞内转座子的沉默
lncRNA >200 多种途径基因组印记和 X 染色体失活
========================
图 2 siRNA、miRNA 及piRNA 的生物合成[26, 27, 58]
a: (人类)siRNA 来源于长的双链RNA 分子, 经Dicer 酶剪切为21~25 nt 的双链RNA 片
段, Dicer 酶和dsRNA 结合蛋白将siRNA 二聚体装载至Argonaute 蛋白(AGO2)而发挥作
用;
b: (人类)miRNA 由内源性的生物体基因产生含有发卡结构的65~70 nt 长的pri-miRNA,
该发卡结构在细胞核内经Drosha-DGCR8 复合物加工产生pre-miRNA。在细胞浆内, pre
-miRNA 进一步经Dicer 酶剪切为miRNA-miRNA*二聚体 (其中miRNA为引导链, miRNA*
为信息链), 装载至Argonaute 蛋白1(AGO1) 而发挥作用。
C: (鼠类) piRNA 的生物合成尚不清楚。piRNA 来源于单链RNA前体, 而且不依赖于
Dicer 酶。产生的初级正义piRNA 倾向于与 MILI 结合, 在出生前的睾丸、MILI 和
MIWI2 均参与复制周期, 在次级反义piRNA 中MIWI2 比MILI 更为丰富, 次级反义piRNA
可能直接裂解转座子mRNA。 | s******y
发帖数: 28562 | 3 很好的综述
【在 g*********d 的大作中提到】
: 夏荣辉，李江
: 上海交通大学医学院，上海（200011）
: E-mail：e******[email protected]
: 摘 要：基因的表观遗传学修饰正越来越受到人们的重视，它包括DNA甲基化和组蛋白修
: 饰，组蛋白修
: 饰又包括组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化。基因的表观遗传学改变在基因转录调节方面有
: 重要作用。最
: 近研究较多的是多种组蛋白修饰方式和DNA甲基化在基因转录调节方面的共同作用，本
: 文详述组蛋白
: 修饰和DNA甲基化的发生机制，并且总结了组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化与DNA甲基化之
| g*********d
发帖数: 233 | 4 Box 1. Properties of euchromatic and heterochromatic regions
Trying to define heterochromatin is like trying to define life itself: a
cluster of important properties can be specified, but there are exceptions
in every instance. For example, centromeres are usually associated with
blocks of flanking heterochromatin. However, the inner centromere of
Drosophila chromosomes is associated with blocks of nucleosomes that contain
CENP-A (also known as CID), a variant of histone H3, interspersed with
blocks of nucleosomes that contain H3 with a different modification
pattern78. The elements at the telomeres of Drosophila chromosomes are non-
LTR (non-long terminal repeat) retrotransposons, which are transcribed79. By
contrast, the proximal telomere-associated sequences show more of the
properties of heterochromatin. The characteristics listed in the figure are
most consistently observed in pericentromeric heterochromatin: that is, in
the regions that flank the centromeres of many eukaryotic chromosomes. These
regions are rich in remnants of transposable elements. It should be noted
that little is known about either the stoichiometry of HP1 or the folding of
the chromatin fibre in heterochromatin; the figure is meant to convey only
the association of HP1 and the condensation of the chromatin fibre.
http://www.nature.com/nature/journal/v447/n7143/box/nature05914 | g*********d
发帖数: 233 | 5 The role of small non-coding RNAs in genome stability and chromatin
organization
http://jcs.biologists.org/content/123/11/1825.full
Josien C. van Wolfswinkel and René F. Ketting*
Journal of Cell Science 123, 1825-1839
© 2010. Published by The Company of Biologists Ltd
doi:10.1242/jcs.061713
Summary
Small non-coding RNAs make up much of the RNA content of a cell and have
the potential to regulate gene expression on many different levels.
Initial discoveries in the 1990s and early 21st century focused on
determining mechanisms of post-transcriptional regulation mediated by
small-interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs). More recent
research, however, has identified new classes of RNAs and new regulatory
mechanisms, expanding the known regulatory potential of small non-coding
RNAs to encompass chromatin regulation. In this Commentary, we provide
an overview of these chromatin-related mechanisms and speculate on the
extent to which they are conserved among eukaryotes.
Key words: Argonaute, Chromatin, Germ cell, Methylation, piRNA, siRN
http://www.hubrecht.eu/research/ketting/documents/1825.pdf
Chromosomes need functional centromeres for reliable segregation during
cell division. The functional domains of the centromere are well
conserved, although the sequences involved are highly divergent among
organisms. The core domain (shown in green in upper figure) – marked by
the centromere-specific H3 variant CENP-A – constitutes the platform on
which the inner and outer kinetochores (light and dark blue,
respectively) are built, and connects the chromatids to the microtubules
of the spindle (black). The pericentromeric regions (brown) assist in
the loading of CENP-A onto the central core and bind cohesins (which
keep sister chromatids together during spindle formation). In addition,
they form a rigid heterochromatic structure that helps the chromosome to
orient its chromatids in a way that favors bipolar spindle attachment.
The S. pombe centromeric core consists of a short conserved core
sequence flanked by the inverted inner repeat (imr). The pericentromeric
region consists of outer repeats, which vary in length between
chromosomes and contain alternating dg and dh elements. No transposon
sequences are located in the S. pombe centromeric region, although dg
and dh repeats might be derived from ancient transposon remains (Baum et
al., 1994; Clarke et al., 1986; Hahnenberger et al., 1991; Kniola et
al., 2001; Nakaseko et al., 1986; Partridge et al., 2000). The A.
thaliana centromeric core region consists primarily of thousands of
repeats of a 180 bp element (cen180) interspersed with multiple copies
and remains of the Athila retrotransposon (106B; orange). The
pericentromeric region also contains many copies of Athila and other
retroelements and DNA transposons, as well as stretches of short
transposon remains (Copenhaver et al., 1998; Copenhaver et al., 1999;
Heslop-Harrison et al., 1999; Kumekawa et al., 2000; Richards et al.,
1991). The human centromere consists mainly of α-satellite repeats. In
the central region, these repeats are organized into higher-order
repetitive arrays; however, not all of these arrays are occupied by
CENP-A, so some of them are actually part of the pericentromeric region.
Outside this area, there are monomeric α-satellite repeats, which are
interrupted by blocks of SINE and LINE elements (orange) and some
stretches of unique sequence (yellow) (Horvath et al., 2000; Jackson,
2003; Manuelidis and Wu, 1978; Schueler and Sullivan, 2006; Spence et
al., 2002; Tyler-Smith et al., 1993; Warburton et al., 1997; Wevrick and
Willard, 1989; Willard et al., 1983; Yang et al., 1982). C. elegans (not
shown) is holocentric and therefore many sites along the chromosome act
as a centromere and recruit centromeric proteins necessary for
segregation. No specific centromeric sequences or nucleating regions
have yet been described in worms (Buchwitz et al., 1999; Moore et al.,
1999; Oegema et al., 2001). | g*********d
发帖数: 233 | 6 MicroRNA 和病毒
作者：王磊
上海交通大学生命学院研究生
摘要：
microRNA(miRNA)是真核生物体内一组内源性的 21—25nt 长的非编码蛋白质的短序列
RNA，它们能通过碱基配对的方式与生物体中的 mRNA 分子相结合来参与调节基因的表
达。自 2000 年至今，miRNA 的研究发展的速度极快并且影响的范围也非常的广泛，而
且分别在2002年和2003年度中miRNA入选了Science杂志年度十大科技突破。因此，
miRNA是 RNA 研究的又一个突破，被称为 RNA 的第二次革命。目前的研究已发现
miRNA 参与了很多重要的生命活动过程涵盖了发育、凋亡、代谢、人类疾病以及病毒侵
染等方面。在病毒侵染宿主和宿主抵抗病毒的过程中病毒编码的 miRNAs 和宿主编码的
miRNAs 均发挥了重要的作用。这无疑为病毒的侵染以及宿主抵抗病毒的侵染的研究提
供了新的思路和新的领域。因此，本文的主要目的在于阐述 miRNA 的一些基本概况以
及在病毒中主要的研究方向和进展，最后对这个具有跨时代意义的小分子进行展望。
关键词：miRNA vmiRNA 功能 宿主的 miRNA 展望
引言
微小 RNA (miRNA)是一类新发现长度为 21—25nt 非编码的小分子 RNA，它们能以序列
特异性方式与其靶点结合从而调控基因表达，其调节类似于蛋白质但是方式不同。最新
研究发现许多病毒自身编码了 miRNA(vmiRNA— viral miRNA)，这暗示了病毒也利用这
种小分子 RNA 来进行基因的调控与表达。目前，虽然已经对疱疹病毒属、多瘤病毒属
和反转录病毒这三个不同病毒家族的 vmiRNAs 进行了靶点的预测以及其功能的研究，
并取得了一定的
成成果，但是对于其他病毒属的 vmiRNA 的功能和作用机制仍然未知。经研究，vmiRNA
可能对宿主的或病毒的基因实施调控，从而影响病毒复制、感染以及宿主抵抗病毒等过
程。
同时，宿主细胞编码的 miRNA 也会影响病毒的复制等过程。因此，深入理解这些
vmiRNA以及宿主细胞的 miRNA 在病毒感染过程中的作用，将有助于了解病毒侵染和致
病的机理以及宿主抵抗外源病毒侵染所采取的方式，从而为抗病毒药物靶点的选择和抗
病毒新疗法的开发奠定基础。
1. miRNA 概况
1.1 miRNA 的发现
在 1993 年Lee等【1】
对线虫发育过程的研究中，注意到在早期发育起作用的lin一 4 基因的突变引起线虫发
育事件延迟，而在其靶标lin一 14 基因缺失突变的线虫中观察到了相反的发育表型即
跃过U 期直接进入了L2 期。经研究发现，lin一 4 的转录产物中有一个长度为 22 nt
的非编码蛋白质RNA，该RNA可部分互补结合在靶mRNA 端非翻译区(3’-UTR)的 7 个保
守位点，从而下调LIN一 14 蛋白的表达水平，使线虫由Ll期向L2 期转化。因此，lin
一 14抑制了LIN一 14 蛋白的翻译暗示了一种发育中基因调控的新机制。但是这一发现
在当时未引起足够重视，由于没有其他的miRNA被发现以及对于小分子RNA认识上的缺乏
。直到 2000年，Reinhart【2】等又在线虫C．elegans中发现了第 2 个异时性开关基
因let一 7，其作用方式与lin一 4 相似，let一 7 结合在lin一 41 和lin一 57 mRNA
3’， 3’UTR抑制靶基因的翻译。在
此之后，掀起了一场对miRNA研究的热潮。在短短几年内，不同的研究小组已相继在线
虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和人类细胞等多种真核模式生物和细胞中找到了上千
种的miRNA。其数量大约相当于每种生物体蛋白编码基因的 1％。
vmiRNA首先发现于Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr Virus)基因组中。2004 年，
Pfeffer等【4】在埃博拉病毒(epstein-barr virus，EBV)中发现了 5 种病毒编码的
miRNA 。这一突破性的发现标志着miRNA在病毒研究中的开始。目前为止，通过在病毒
感染的细胞中利用cDNA克隆
以及生物信息学等方法，已经在疱疹病毒(herpesvirus)、多瘤病毒(polyomaviruses)
、腺病毒(adenoviruses) 以及逆转录病毒(retro—viruses)中发现了上百个vmiRNA。
1.2 miRNA 生物学特征
miRNA 其本身有许多的生物学特征，包括以下几个方面：
(1) miRNA的基因在进化上呈保守趋势。在已克隆到的miRNAs中，几乎所有的miRNAs的
基因存在于相近动物中，例如，C．elegans中多于 1/3 的miRNAs与人类同源【5】。并
且本身不具有开放阅读框架，不编码蛋白质。
(2) miRNA基因多数并非随机排列的，而是成簇存在，而且簇生排列的基因常协同表达
【6】【7】。目前已知miRNA基因簇现象在果蝇中广泛存在，有超过一半的miRNAs是簇
集的。
(3) 成熟的 miRNA 5’端一般会有一个磷酸基团，3’端为羟基。其长度为 19~25 nt
，但在3’端多出 2 个悬挂的碱基。
(4) 具有细胞特异性和组织特异性。例如miR-171 在拟南芥的花序和花组织中高水平
表达，而在茎、叶组织中却没有表达的迹象【8】。
(5) 具有时空特异性。目前研究较清楚的lin-4 与let-7 呈时间特异性表达。此外例
如从miR-3 到miR-7 基因只在果蝇早期胚胎形成时表达，在其他阶段未表达；而miR-12
、miR-21和miR-28 从果蝇幼虫阶段才开始表达，并在成虫期维持在较高水平【9】。
2. VmiRNA 的功能
通常情况下，vmiRNA是由病毒基因中与编码病毒蛋白相反的那条链所产生的，
这就表明 了vmiRNA和 其 靶mRNA是 以 一 种 完 全 配 对 的 方 式 来 发 挥 作 用
的 。 同 时 这 种 结 合 表 明vmiRNA 能够控制病毒蛋白的表达从而控制病毒。因
此这种控制能够影响在细胞裂解或复制潜伏期的调节蛋白的表达例如，EBV的一种转运
蛋白（LMP1-潜伏期相关的膜蛋白）就被此病毒的BART miRNA簇所调节。这类vmiRNA作
用于LMP1的mRNA的3’端并且抑制LMP1的表达。这种调节的结果影响了LMP1诱导的NF-κ
B的新号途径和凋亡的抗性。因此，这种调节效应合理的解释了LMP1和相应的miRNA在鼻
咽癌的表达量的不一致，以及在鼻咽癌中存在不同水平的LMP1的原因【11】。
最近的研究还表明vmiRNA能够帮助病毒逃避细胞毒T细胞反应(CTL -cytotoxic T cell
CTL在抗病毒免疫中发挥着重要作用)。猿猴空泡病毒(simian virus 40，SV40)编码的
vmiRNA为了逃避 CTL对病毒感染细胞的识别和裂解从而有效下调一组有关病毒早期的基
因表达。
SV40在感染晚期主要表达miRNA，并大量积累。vmiRNA的表达对病毒复制并没有影响，
但是降低了T抗原的表达。由于T抗原表达的降低导致了T细胞对其病毒所感染细胞的灵
敏性有所降低。因此，vmiRNA帮助伪装了病毒感染的细胞从而避免细胞免疫系统的识别
【12】。
据现有的报道，vmiRNA还可能控制病毒的感染。Dunn等报道了人巨细胞病毒(human
cytomegalovirus，HCMV)在临床上相关的4种人细胞：内皮细胞、成纤维细胞、上皮细
胞和星形(胶质)细胞，其裂解性侵染过程中均表达了miRNA。而且，通过分离HCMV后均
可检测到miRNA的表达。Omoto等【14】
研究展现了HIV-1持续感染细胞所产nef的可能性。Nef是一种小发夹RNA(short hairpin
RNA，shRNA)与并且与之前预测的nef (大约25 nt，miR-N367)相符，它的主要功能是
在体外阻止HIV-1中nef的翻译。而且由miR-N367引起的抑制作用与长期非进行性低病毒
血症的发生有密切的联系。在长期非进行性小鼠模型中，可能由nef引起的体重减轻也
能被miR-N367抑制，与体内nef表达抑制相一致。这些都表明了HIV-1感染细胞中
产生的nef／U3 miRNA可能通过RNA干扰途径（RNAi）抑制nef的功能和HIV-1毒力。
因此，从以上所列举的功能上可以看出 vmiRNA 主要以一种基因沉默的方式来降解靶
mRNA 或抑制其翻译。同时，vmiRNAs 还特异性的调控宿主或病毒基因的表达与否，从
而在病毒的复制侵染等方面起着非常重要的作用。3．宿主细胞的 miRNA 在病毒侵染过
程的作用 前面已经提到了病毒可以通过自身的基因组编码vmiRNA，从而影响宿主的基
因表达。
那么一些科学家就开始猜想宿主编码的miRNA是否也能对病毒的表达产生影响呢？近来
，一部分的报道已经证实了这一点。大多数的情况下，被病毒感染的细胞编码的miRNA
能够调节病毒的复制。例如，人类的miRNA-32 已经被报道能够限制 1 型灵长类泡沫病
毒的复制（PFV-1—primate foamy virus type 1 ）【15】。敲除宿主细胞的miRNA-
32 之后发现病毒
的复制变快。因此表明miRNA-32 对PFV-1 的复制有负调控的作用。同样的，在 1 型丙
型肝炎病毒（HCV-1）还发现了一部分HCV-1 的mRNA的 3’端由于被人类一簇miRNA（包
括miR-28，miR-125b,miR-150, miR-223 and miR-382)所结合,从而导致翻译的抑制（
16），
说明了这类miRNA对病毒有抑制作用。此外，还有报道称宿主细胞编码的miRNA对于EB病
毒或流感病毒(Influenza virus)靶基因可能也具有抑制作用。但是，有趣的是一部分
宿主编码的miRNA也能对病毒有正调控的作用。Jopling等【17】报道了宿主miRNA中特
异表达的miR-122可引起HCV的mRNA表达水平的上升，虽然其具体的作用机制还不清楚，
但miR-122 与HCV
基因组 5’端非编码区域相互作用是必需的。因此，我们可以看出宿主的miRNA对病毒
的基因的表达既有负控的作用，又有正控的作用，其机制是复杂的。
4. 病毒抵抗宿主的 RNA 干扰的方式
从前面所讨论的可以看出，宿主为了避免病毒的侵染而采用miRNA等小分子对
病毒进行RNA干扰来抑制或者阻断病毒的侵染。同时，病毒也会巧妙的运用各种方式来
躲避这种RNA的干扰从而保护自身。下面将仅列举出是目前为止发现的一些防御宿主RNA
干扰的主要途径。有的病毒能够保护自己的基因组从而抵抗宿主的RNA干扰作用【18】
。有的病毒会合成RNA结合蛋白，这种结合蛋白会与宿主的小分子RNA相结合从而阻断了
RNA干扰的途径【19】
达到保护效果。另外，有的病毒还通过突变自身基因组的重要基因或改变其转录本的二
级结构从而避免小分子RNA干扰途径的发生【20】。
5. 展望
在过年十年中，miRNA 发展速度如此之快，这是始料未及的。虽然很多学者已
经做了大量的有关病毒 miRNA 的研究，但是这些研究只是触及到表面。因此，还需要
更加深入与透彻的研究来阐明 VmiRNA 和宿主编码的 miRNA 的功能、机理，调节途径
以及相关的基因。同时，运用生物信息学的方法来发掘新的病毒 miRNA 以及这些
miRNA 的靶位点也是必不可少的。另外，包括 miRNA 的测序，低表达量的 miRNA 提取
等技术的进步与发展仍然是主要难题和挑战。VmiRNA 与宿主的 miRNA 所产生的防御与
反防御，浸染反侵染仍是是未来研究的热点。由于 miRNA 途径的专一性强以及效果明
显等特点，使这种小分子 RNA极有可能成为未来治疗包括艾滋病、肝炎等病毒疾病的特
效基因药物。所以，miRNA 不仅在生命科学领域中引起了新的浪潮，而且更可能为人类
基因药物的开发作出重大的贡献。
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http://micro.sjtu.edu.cn/paper/1080809085.pdf | g*********d
发帖数: 233 | 7 《Cell》文献翻译:基因表达的小RNA调节因子
Cell 134, 899 – 902, September 19, 2008
Joel R. Neilson and Philip A. Sharp
今年Lasker基金会承认了Victor Ambros、Gary Ruvkun和David Baulcombe在推断
小RNA分子在真核基因表达的转录后调节中所进行的开创性工作。
分子生物学是一门年轻的学科，如同充满了未开发土地的新大陆。有关小RNA在基
因调节中的作用的重要发现是这门年轻学科中还有许多未开发的重要领域的一个例证。
9月26日，几位先驱（麻州大学医学院的Victor Ambros、麻州总医院和哈佛大学医学院
的Gary Ruvkun和剑桥大学的David Bulcombe有关小RNA的发现将被授予2008年Albert
Lasker基础医学研究奖。
历史上先驱者以及他们的发现的意义通常被忽略，只是在很多年之后才被承认。
Ambros和Ruvkun所发表的描述第一个微RNA及其标靶的优秀论文（发表在高深的Cell杂
志上）被忽略了近10年。与此同时，Baulcombe在一个被遗忘（至少被美国联邦基金所
遗忘）的植物分子生物学的一个领域工作。他发现小RNA分子与依赖于同源性的基因沉
默（也称为共抑制或RNA干扰）有关，这意味着推测出了基因沉默的化学和生物化学。
这些天才研究人员的工作从根本上改变了科学界对转录后基因调节的观念，证实了在小
RNA分子起作用的动植物细胞中生物过程的复杂性。
蠕虫突变体和微RNA
事情的开端与Chalfie、Horvitz和Suiston 1981年在Cell杂志中描述的两个线虫突
变体有关。Unc-86和lin-4这两个突变体改变了通常不变的的线虫细胞发育。在这些突
变体中，各种细胞系在某个发育点被“卡”住，然后反复重复细胞分裂模式。
作为Hovitz实验室博士后的Victor Ambros被上述观察所吸引。他根据线虫lin-4突
变体不能产卵的观察，假定其他不能产卵的突变也有类似的异常。对有产卵缺陷的突变
体的检测揭示了lin-14、lin-28和lin-29突变体与细胞系发育异常有关。这些突变导致
产生两类不规则的细胞系发育：（1）“早熟”，某些在野生型线虫中发生的发育过程
提前进行；（2）“滞后”，某些在野生型线虫中发生的发育过程延后进行。基于上述
观察，新突变体被统称为“非同步”突变体。
在上述研究中揭示的最重要的基因是lin-14，该基因的各种等位基因有与早熟或滞
后细胞发育相反的表型。有趣的是，lin-14的半显性滞后等位基因的表型与在lin-4突
变中观察到的缺陷相同，而lin-14隐性早熟等位基因产生的发育缺陷与在lin-4突变体
中观察到的缺陷相反。Ambros使用19个不同的突变体和lin-14温度敏感基因，很快确定
了lin-14滞后突变基因是获得功能基因，lin-14早熟突变基因是丧失功能基因，并推断
出这两类基因在发育过程的不同时间影响表型。这些数据表明lin-14的功能一般在发育
晚期下降，由此产生了两个重要问题：
（1）在发育过程中，lin-14的功能在时间顺序上是怎样调节的？
（2）lin-14突变怎样影响其功能？"
回答这些问题的最直接的方式是在分子水平上确定lin-14基因的功能。为此目的，
Horvitz实验室的另一个博士后Gary Ruvkun领导进行了包括Ambros在内的富有成果的合
作。这些研究揭示了半显性的lin-14获得功能突变是lin-14基因3’区域的删除或重排
。已知该断裂序列为一个对lin-14基因活性进行负调节的因子编码，但不清楚这种调节
是发生在DNA、RNA或蛋白质水平。在此之前，Ruvkun和Ambros已分别在哈佛医学院/麻
州总医院和哈佛大学建立了自己的研究小组。这两位研究者继续对非同步蠕虫基因进行
研究，并于1989年各自独立发表了相关基因，特别是lin-14基因的深入研究结果。
Ruvkun制备了lin-14基因产物的抗体，证实该蛋白质位于所有受lin-14突变影响的
细胞的细胞核中，但该蛋白质的表达有时间限制。在野生型线虫中，lin-14蛋白存在于
幼虫发育初期(L1)阶段细胞的细胞核中，而在发育的下一个阶段(L2)不复存在。相反，
在lin-14获得功能突变体中，Lin-14蛋白质的表达在幼虫发育的所有阶段都持续进行，
甚至在成虫中也可观察到lin-14的表达。这些结果是对Ambros的遗传学研究的补充，提
供了在L1/L2转换阶段，Lin-14蛋白质表达的下降对正常发育至关重要的补充证据。
在Ruvkun的研究发表了2个星期之后，以Ambros为作者的研究得以发表，描述了lin
-4、lin-14、lin-28和lin-29突变体的异位显性分析。Ambros通过分析携带这些突变的
各种组合的线虫，使这些基因进入一条令lin-4对lin-14和lin-28进行负调节的途径，
然后lin-14和lin-28对lin-29进行负调节。Lin-29在同时缺少lin-4、lin-14和lin-28
的情况中，可使线虫幼虫完全转换成为成虫。
尽管已很清楚lin-4基因可使lin-14和lin-28基因“关闭”，但异位显性分析无法
确切地解析lin-4是分别调节lin-14和lin-28，还是通过其中一个基因调节另一个基因
。尽管如此，由于lin-14获得功能和lin-4丧失功能突变体有类似的表型，Ruvkun和
Ambros都推测lin-4可能是通过在lin-14获得功能突变体中丢失的因子对lin-14进行负
调节（可能是直接调节）。
Ruvkun在约2年后发表了背靠背的研究，对lin-14调节的性质有了新的了解。对为
lin-14编码的遗传基因的深入分子鉴定揭示了lin-14获得功能突变位于lin-14基因编码
的转录产物的3’非翻译区(UTR)，表明这类突变不影响蛋白质编码序列。由于在这些突
变体中lin-14 mRNA表达水平正常，所以突变很可能破坏了一个作用于RNA的负调节因子。
Ruvkun小组通过分析lin-14蛋白在非同步突变背景下的表达，证实了lin-14受lin-
28和lin-4的拮抗调节。尽管在lin-4丧失功能突变体中，lin-14蛋白的表达在其后的L1
阶段并未减少，但在lin-28突变体中，lin-14蛋白的表达在L1阶段提前消失。这些结果
理清了Ambros提出的途径的顺序，表明lin-4基因产物（或某种由该产物调节的因子）
可直接与在lin-14获得功能基因中缺失的lin-14 3’-UTR区域直接结合。剩下的问题十
分清楚：lin-4的分子特性是什么？lin-4是直接还是间接调节lin-14？两年后Ambros和
Ruvkun进行的背靠背研究回答了这些问题。
Ambros的研究描述了lin-4基因的分子克隆。令人惊讶的是，产生lin-4表型的几千
碱基的基因组区域只需693个基因组碱基对便能得到互补。从几种不同线虫中得到的相
应区域也能援救lin-4表型。尽管Ambros及其团队的深入分析揭示了在四种线虫中有两
个保守的DNA序列区域，但他们无法鉴定任何可能的蛋白质编码序列，无法在这些区域
鉴定出规范的起始或终止密码。破坏潜在编码序列的突变对lin-4的援救没有影响。
Ambros等迅速向前推进。Northern分析揭示了lin-4基因区产生两个可测定的RNA：
一个微量的61核苷酸产物和一个主要的~21核苷酸产物。这两个RNA产物相互关联，小产
物相当于大产物最靠近5’端的21个核苷酸。为了证实这两个RNA确实影响lin-4基因功
能，Ambros实验室筛选了20000多个染色体，鉴定了第二个lin-4突变，称为lin-4(
ma161)。这个突变体基因在两个lin-4基因产物的5位有所改变，从胞嘧啶转换成胸腺嘧
啶。因此这两个基因产物中的一个或二者肯定可影响lin-4基因功能。
与此同时，Ruvkun及其同事继续对他们早先观察到的lin-14获得功能突变所处的
lin-14 3’-UTR区域进行研究。用处于不同发育阶段的线虫进行的免疫印迹和核糖核酸
酶保护实验清楚地证实，lin-14基因是在特定发育阶段受转录后调节。在野生型线虫中
，尽管在幼虫发育的第一阶段后lin-14蛋白不复存在，但lin-14 mRNA在所有幼虫阶段
，甚至在成虫阶段都稳定表达。Ruvkun的团队在线虫C. elegans和C. briggsae中使用
报告基因证实了lin-14的3’-UTR对所观察到的转录后调节是足够的，这种调节在两个
lin-4突变体[包括经典的lin-4(e912)和新分离到的lin-4(ma161)基因突变]中受到破坏
。Ruvkun和Ambros的研究小组都注意到从lin-4基因产生的小RNA与lin-14 3’-UTR中的
7个部分重复序列互补(lin-14 3’-UTR在lin-14获得功能突变基因中或全部或部分缺失
)。Ambros和Ruvkun的结论是lin-4基因产生的短RNA通过与lin-14 mRNA 3’-UTR的重复
序列的碱基配对，对lin-14基因产物进行直接调节。
Ruvkun研究小组在一项后续研究中基本证实了lin-4和lin-14之间进行直接相互作
用的模型。他们证实在推测的lin-14 3’-UTR的lin-4结合位点的点突变可在体内破坏
报告基因的发育阶段专一性调节，在杂合UTR上进行有凸出结构的潜在lin-4位点的引入
可产生发育阶段专一性调节。此后不久，Ambros的研究小组确定了lin-28是lin-4的第
二个靶点，获得并鉴定了一个lin-4获得功能突变基因。另一项研究证实，lin-4通过在
lin-14 mRNA翻译起始后阻断lin-14蛋白质合成而发挥作用。但这些观察对已有的基因
调节的规则的重要性尚不清楚。除了线虫，没有其他有关lin-4基因产物保守性的证据
。即使在线虫中，lin-4也是以这种方式起作用的小RNA的唯一例子。
当Ruvkun的研究小组与Horvitz和Ann Rougvie的实验室合作，描述了let-7基因的
分离和鉴定时，事情有了根本的改变。let-7与lin-4类似，为一个小RNA编码，这个小
RNA通过在该基因3’-UTR的保守序列对另一个基因(lin-41)进行负调节。与lin-4不同
的是，let-7在各种动物中广泛存在。在描述了let-7后的短短二十个月后，Ambros、
David Bartel和Tomas Thschi的研究小组同时发表了证明有几百个类似于lin-4和let-7
的基因存在的研究数据，这类基因存在于从蠕虫到人类等各种生物中。微RNA被再次引
入科学界，这一次引起了科学界的注意。
植物中的短RNA和基因沉默.
在动物中存在着几百个为起调节作用的短RNA编码的基因，这项发现令人震惊，但
在植物中的研究显示了调节基因表达的RNA的重要性。
David Baulcombe在90年代初期研究经基因工程改造后的植物的病毒抗性。那时的
主要方法是通过病毒蛋白或有高级结构的核酸基序的转基因超量表达，竞争性地抑制重
要的病毒因子或寄主因子，主动干扰病毒复制。但是很快就认识到即使转基因不为蛋白
质序列编码，也能通过该转基因使植物产生病毒抗性。用带有序列同源性的病毒感染转
基因植物导致病毒RNA和转基因RNA稳态水平下降，尽管来自转基因的转录保持不变。这
些观察产生了这样一个模型，即病毒抗性是通过可降解病毒RNA的转录后机制介导的。
在转基因植物中，病毒抗性和依赖于同源性的基因沉默之间的相似性说明这两个过程有
相关性。
Baulcombe研究小组在90年代中期发表的一系列植物研究中，强化了依赖于同源性
的基因表达和病毒抗性之间的关系。他们的第一项研究比较了几种转基因植物的病毒抗
性，注意到产生病毒抗性的转基因可产生较低水平的稳态转基因RNA，可反式抑制来自
其他转基因的同源RNA的累积。这些转基因产生的病毒抗性有高专一性的特点：对某些
马铃薯病毒X品系有抗性的转基因植物株对与该病毒高度相关的品系没有抗性。
Baulcombe的第二项研究证实，非病毒转基因的沉默可阻止经基因工程改造过的含
该转基因同源序列的病毒的累积。这项研究揭示了是序列特性，而不是序列来源，造成
了沉默的转基因与植物RNA病毒之间的相互作用。另外一些研究使用了从番茄黑环病毒
感染后“恢复”的植物，揭示了这些植物对第二次病毒接种的感染有抗性。尽管恢复后
的植物对其他病毒敏感，但如果在用于第二次接种的杂合病毒中含有在第一次接种的病
毒的RNA非编码区，这些植物对对第二种病毒有抗性。在病毒诱导的保护与转基因诱导
的沉默之间的相似性使Baulcombe得出这两种现象都有基于RNA的机制起作用的结论。
之后不久，Baulcombe研究小组使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因烟草的土壤杆
菌入渗，证实存在着一种可介导植物转基因的序列专一性沉默的系统信号。GFP的系统
沉默也可用包金颗粒DNA进行诱导，在与沉默最早开始的根部结合后，可扩散到非转基
因组织。沉默信号扩散的方式和动力学表明它可通过细胞间的胞间连丝以及通过韧皮系
统进行扩散。沉默信号可能是一种核酸。
尽管大多数证据认为各种形式的转录后基因沉默（包括共抑制和抗病毒活性）的中
介物是反义RNA，但没有人鉴定出对靶序列而言是反义的RNA。Baulcombe推测用来寻找
与转录后基因沉默有关的反义RNA的方法可能漏悼了“很小的、非均一扩散的”RNA，它
们很可能是植物编码的依赖于RNA的RNA聚合酶的产物。Baulcombe在1999年与Andrew
Hamilton一起完成的工作证实确实如此。
对三个显示了内源基因的转基因诱导转录后沉默（共抑制）的转基因番茄的研究揭
示了与转基因相对应的正义和反义~25核苷酸RNA。有趣的是，在其他有相同转基因但不
显示共抑制的番茄中没有这类短RNA。他们进一步证实，在有转录后基因沉默的转基因
烟草中存在反义RNA，尽管这种烟草的转基因与内源序列没有任何同源性。在转基因不
沉默的烟草中没有这类反义RNA。短反义RNA与沉默的基因有关的现象在另外两个基因沉
默模型中也能观察到：（1）在土壤杆菌渗入后的系统性转录后沉默的过程中；（2）在
用马铃薯X病毒感染的植物中。很清楚，一再被观察到的不同类型的转录后基因沉默的
相似性有一个共同点：短RNA与被沉默的基因有互补性。
前瞻
Victor Ambros、Gary Ruvkun和David Baulcombe的开创性研究揭示了小RNA在调节
各种生物基因中的重要性。RNA干扰的生化分析导致了小干扰RNA(siRNA)的发现，siRNA
已成为使哺乳动物基因沉默的普遍工具，并有可能成为治疗疾病的药物。微RNA可调节
一半以上的哺乳动物基因，各种不同微RNA的活性与癌症、炎症、神经发育和慢性心脏
病有关。在植物中，这些RNA通过启动另一些反式作用小RNA的产生，调节各种发育过程
。不了解小RNA所起的作用便无法理解多细胞生物的生物学。
可能还有许多由不同过程产生的其他类型小RNA，它们有不同的功能。例如，piRNA
是一类新的小RNA，它们主要存在于生殖细胞中。这些RNA至少是部分通过表观遗传学机
制控制生殖细胞中重复序列的表达。尽管存在许多较长的的非编码RNA，但它们的特定
功能还有待确定。这方面的例子包括Xist RNA与X染色体失活的关系以及U19RNA与lgf基
因的印痕关系。在脊椎动物中有几千种这类RNA。Ambros、Ruvkun和Baulcombe的突破性
研究凸显了我们对非编码RNA生物学的理解才刚刚开始。
本文转自建人先生原创，感谢
http://www.stemcell8.cn/thread-10764-1-1.html | g*********d
发帖数: 233 | 8 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色不但没有变得更鲜艳, 并且连内源性的查尔酮基因也被沉默, 最终花瓣的颜色
却褪掉了。当时把这种现象称为基因共抑 制 或 同 源 基 因 沉 默 (homology-
dependent gene silencing) 。1994 年, 意大利的 Cogoni 等将外源性类胡萝卜素基
因导入链孢菌, 结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因受到了抑制。当时称这种基因
失活形式为 “quelling” 现象 。 1995 年, 康乃尔大学的 Su Guo博士在试图阻断秀
丽新小杆线虫 (C.elegans)par- 1 基因时, 利用反义 RNA 技术特异性地阻断上述基因
的表达, 而同时在对照实验中给线虫注射正义 RNA以期观察到基因表达的增强, 但结果
是二者都同样地切断了 par- 1 基因的表达途径。这与传统的对反义 RNA技术的解释正
好相反。该基因组一直未能给这个意外以合理的解释。直到 1998 年 2 月, Andrew
Fire 和 Craig Mello证实上述现象是由于 ssRNA中混有 dsRNA而导致的, 当通过纯化
的方法把这些双链 RNA 彻底清除掉, 所得的结果与以前则大不一样, 经纯化的正义
RNA链分子完全丧失了抑制目标基因的功能, 而经纯化的反义 RNA链抑制目标基因的效
能也大大降低, 而经过纯化的双链 RNA却正好相反, 能够高效特异性阻断相应基因的表
达, 其抑制基因表达的效率比纯化后的反义 RNA至少高 2 个数量级, 并首次将这一现
象称为 RNA干扰。
此后, 在短短的一年中,研究证实 RNAi 现象广泛存在于真菌、 拟南芥、 蜗虫
、 水螅、 斑马鱼等大多数真核生物中。随后 Wianny及 Elbashir 等报道了哺乳动物
细胞的基因沉默现象, 即用小干扰 RNA (siRNA)在小鼠和人的细胞中诱导产生了特异性
的 RNAi 。后来 Paddison 的试验表明, siRNA 可以稳定地抑制小鼠的体细胞和胚胎干
细胞的基因表达。至此, 人们认识到 RNAi 作为研究基因功能的一种有力的革命性的工
具, 在哺乳动物基因研究中有着广阔的应用前景, 尤其是在转基因动物的制备、 基因
治疗、 药物开发方面具有巨大的潜力。为此 RNAi 名列 《Science》 杂志 2002 年
10 大科学成就之首,并且该现象的发现者在 2006 年也荣获了诺贝尔生理学医学奖, 从
此 RNAi 成为分子生物学领域的研究热点。
2 RNA干扰的过程
2.1 RNAi 的作用机制在对线虫、 果蝇、 植物和动物卵细胞 RNAi 现象的不断研究中
, 相继发现了一些与 RNAi 作用相关的酶和蛋白, 从而使 RNA干扰的作用机制逐步被阐
明。但是 RNAi 作用的确切机制尚不清楚, 目前普遍认可的是 Bass 假说。其假说具体
概括为 3 个阶段(图 1)。
( 1) 起始阶段。
在细胞内, 双链 RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ (RNaseⅢ) Dicer 在 ATP 的参与下被
处理为 21～ 23 个碱基的小 RNA, 即小干扰 RNA ( siRNA) 。siRNA RNA干扰及其在动
物繁殖中的应用 ( 1.四川农业大学原子能农业应用研究室, 四川 雅安 625014; 2.四
川省巴中市巴州区畜牧兽医学校, 四川 巴州 636000) 摘 要: RNA干扰 ( RNAi ) 是由
短的双链 RNA降解内源的同源 mRNA而引发的转录后基因沉默现象。 RNAi 作为一种调
控特定基因表达的工具, 被称为基因组的免疫现象, 已成为当前繁殖领域的研究热点之
一。该文就 RNAi 的发现、 RNAi 的过程及其在动物繁殖中的应用等方面的研究进展作
一概述。关键词: RNA干扰; 基因; 动物繁殖中图分类号: S814 文献标识码: B 文章编
号: 1005- 2739 ( 2008) 04- 0009- 04 收稿日期: 2008- 04- 18 作者简介: 吴志焕
( 1982- ) , 女, 河北衡水人, 在读硕士。通讯作者: 曾宪垠 x****[email protected] 9
- -黑龙江动物繁殖 第 16 卷 第 4 期 2008 年是由 19～21 个碱基配对形成的双链,
并在其 3′末端有两个游离未配对的核苷酸。研究发现, siRNA 是 RNAi 作用发生的
重要中间分子, 序列与所作用的靶 mRNA的序列具有高度同源性; 双链的两端各有 2～3
个突出的非配对的 3′ 碱基; 两条单链末端为 5′ 端磷酸和 3′ 端羟基。这些是细
胞赖以区分真正的 siRNA和其他双链 RNA的结构基础。 研究表明,平末端的 siRNA 或
失去了 5′ 磷酸基团的 siRNA 不具有 RNAi 的功能。
( 2) 引发阶段。
siRNA与 Argonaute 蛋白家族及其他 结 合 因 子 结 合 , 形 成 siRNA- 核
蛋 白 复 合 物 ( siRNP) 。 siRNP 在 ATP 及其他辅助因子 ( 如催化亚基) 协助下,
使双链 siRNA解旋形成 RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC以 ATP 依赖的方式催化双
链 siRNA解旋。推测以两种方式发生, 或是从 RISC中除去双链 siRNA中的一条链, 或
是使双链 siRNA在空间保持分离。利用 R ISC内部的单链 siRNA,通过碱基配对识别与
之互补的靶 RNA,并切割靶 RNA,并由 RNA酶降解, 从而导致目的基因的沉默。
( 3) 循环放大阶段。
在 siRNA 诱导的 RNAi 过程中, 还存在 siRNA的循环放大过程, 以维持它的
RNA 诱导功能。 此过程推测是以 siRNA为引物,互补 mRNA 为模板,在 RNA依赖性 RNA
合成酶(RdRP)的作用下, 合成新的双链 RNA, 再由 Dicer 作用,产生新的 siRNA, 完成
siRNA的放大过程, 开始新的 RNAi 循环。一般来说, RNAi 的作用机制如上所述。但
不同物种的 RNA干扰机制会有一定的差异, 如植物细胞会在 RNA聚合酶 ( RdRP) 的作
用下, 以外来的 RNA 单链为模板, 合成长 RNA 双链分子, 进入 RNA 干扰的通路。而
哺乳动物细胞内, dsRNA分子 ( > 30 个碱基对) 常常引起非特异性的干扰素反应, 导
致 mRNA翻译成蛋白质的过程停顿, 基因表达受到普遍抑制。但是, 直接把 siRNA导入
细胞内, 则可以避开干扰素的激活, 进入 RNA干扰通路, 特异地降解同源序列的 mRNA
分子, 同时证明了 RNAi 的机制系统普遍存在于在各种细胞内。 2.2 RNAi 的作用特点
应用 RNA 干扰技术抑制特定的基因表达远远优于传统的基因抑制工具, 根本原因在于
RNA干扰是源自细胞内在的基因调节机制, 它沉默细胞基因表达具有普遍性、 高效性、
特异性和可遗传性等显著特点。 3 RNAi在动物繁殖中的应用在动物繁殖领域, RNAi
技术主要应用于研究动物生殖细胞发育和动物胚胎发育过程中重要的基因功能及其作用
机制。近年来该技术在此领域有了突破性的进展, 并随着该技术的不断发展和完善, 其
在动物繁殖生产实践中发挥出的作用也越来越显著。
3.1 RNAi 与动物的生殖细胞发育
长期以来研究人员试图找到一种新型又有价值的技术来控制动物生殖能力, 例
如在体内研究生殖细胞的发育过程及生殖细胞的活力等。但是, 多年来因为体外细胞长
期培养的技术不够成熟阻碍了该研究的进行。而随着 RNAi 技术的不断成熟, RNAi 的
研究将有可能使我们更全面地理解生殖细胞的发育机制。并且近年来亦有很多的相关报
道, 但主要集中在卵母细胞和精子形成过程中相关基因的研究上。Wianny等首次将
RNAi 技术应用于小鼠卵母细胞研究中, 选取在卵泡中表达的 c- mos 基因作为靶基因,
通过显微注射方式导入 dsRNA, 结果与对照组基因敲除小鼠实验结果完全相同, 即 c-
mos 基因表达被抑制,细胞减数分裂停滞在 MⅡ期,说明 RNAi 可以用于哺乳动物细胞
基因功能研究。Crowe 等利用 RNAi 技术分析了线虫体内的 Ring finger protein- 1
(rfp- 1)基因功能, 证明了该基因与外阴的发育有关, 并且它的缺失也会影响雌性动物
的排卵[19] 。Jin Han 等用 RNAi 技术证明了 Wee1B蛋白在小鼠卵母细胞中特异性表
达, Wee1B 蛋白是小鼠卵母细胞中关键的特异的促成熟因子(MPF)抑制激酶, 是维持减
数分裂中止所必需的[20] 。Shaoji 等首次将 RNA干扰技术应用于精子的生成过程中,
他们用电穿孔法向小鼠睾丸内导入外源的报告基因, 然后用同样的方法导入包含 siRNA
的 DNA载体, 发现报告基因的表达量在各个时期均有不同程度的降低, 进一步用 RNAi
技术沉默小鼠精母细胞形成过程中编码 DNA 重组酶的内源性DMC1(Disruption
ofMeiotic Control)基因, 结果显示 DMC1 基因沉默后, 精母细胞发育停滞、 不育,
此实验体系为体内研究精子发生相关基因的功能提供了一条新的思路[21] 。 Williams
等为了研究睾丸组织中的特异性基因功能, 选择了 RNAi 小鼠作为研究对象, 该研究
小组利用 RNAi 对睾丸中的特异性的磷脂酶 c 基因 (PLC-ζ)进行抑制, 结果显示该基
因与精子的生活力有关, 而与精子的发生过程无关[22] 。Fuente 等为了减少螨虫的数
量, 对编码螨虫保护性蛋白的 4D8 基因进行 RNA干扰, 结果显示 4D8 基因不但影响了
螨虫的存活力, 还大大降低了其产卵率, 最终起到了控制螨虫繁殖的作用。在此基础上
该研究小组利用饲养这些生育能力低的螨虫, 然后在一定条件下释放这些螨虫, 大大减
少了野生群体的数量, 相对解决了家畜和人类因螨虫而带来的烦恼 。
3.2 RNAi 与动物的胚胎发育
在发育过程中的不同阶段, 特异性地消除基因的功能是 RNAi 最大优点之一。
诺贝尔奖得主 Fire 等在研究线虫时发现了许多小的 RNA, 其功能是使线虫的发育时间
紊乱, 例如 lin4 和 let7 基因转录的小 RNA可形成发夹状前体, 此前体影响线虫的时
序性表达。 Momoyo等利用 RNA干扰的特异性筛选线虫胚系发育相关基因, 为进一步研
究虫体发育机制打下了基础 , 同时为研究动物胚胎发育的机制起到了重要的前导作用
。Wianny等为了证实 RNAi 是否影响小鼠胚胎中的基因表达, 构建了转基因小鼠检测体
系,该体系在延伸因子 - 1a ( ET- 1a)启动子调控下表达修饰型绿色荧光蛋白 (MmGFP)
, 将 MmGFP 的 dsRNA注入单细胞受精卵, 体外培养 3～4 d 后, 发现未注射 dsRNA的
胚胎中大量表达 GFP, 而注射组只有 6.8%表现出微弱的荧光, 说明 dsRNA可以抑制
GFP 的表达; 但在注入 c- mos 和 E- cadherin 的 dsRNA单细胞受精卵中, GFP 表达
并不受影响,说明 dsRNA具有抑制的特异性。 Pekarik 等首创用 RNAi 和胚内电穿孔相
结合的方法进行活体基因功能研究,采用黄色荧光蛋白(YFP) 作为指示蛋白, 用电穿孔
法将 YFP 和 axonin- 1 的 dsRNA转入鸡胚,发现 YFP 和 axonin- 1 表达量明显降低
。Haraguchi 等在小鼠受精卵原核中注射 Oct4 基因的 siRNA表达载体, 体外培养到囊
胚期阶段检测到 Oct4 基因 mRNA 和蛋白质表达水平的下降, 且胚胎发育阻滞在囊胚期
。 Khang等利用 RT- PCR 的方法检测到 epithin 在小鼠胚胎 1- 细胞到囊胚期的发育
过程中一直都有表达, 通过免疫荧光实验发现 epithin 和 E- 钙黏着蛋白协同定位于
致密化的桑椹胚卵裂球接触面上; 而且利用 RNAi 技术抑制小鼠 epithin 基因的表达
以后, 胚胎发育停滞在 8- 细胞期, 而 8- 细胞期正是小鼠胚胎发生致密化的时期, 表
明 epithin 在胚胎致密化过程中具有重要作用, 并由此推测 epithin 可能诱导胚胎致
密化过程中内细胞团和滋养层细胞的分化。 赵金红等为了研究胚胎 Sry 基因的调控网
络, 采用 siRNA 技术使 Sry 基因沉默, 最终确定了干扰质粒的最佳注射时间、 注射
剂量, 并且干扰质粒的抑制率达 85%左右 。最近耶鲁大学的弗兰克.斯勒克应用 RNAi
技术以 C.elegant 蠕虫为研究对象, 发现某些基因几乎直接参与了对寿命长短的控制,
一种小 RNA 控制着发育时间基因, 这种小 RNA 分子和控制发育时间的基因在非常具
体的阶段控制着发育时间基因, 这种小 RNA分子和控制发育时间的基因在非常具体的阶
段控制着细胞的发育模式, 斯勒克小组发现如果这些基因发生了变化, 就会改变蠕虫的
发育时间和阶段。
研究发现, 基因沉默的系统传播信号与植物成花素(florigen)相似, 都能嫁接传
播, 而不需要任何相应激素或其他信号分子, 都能系统转导并产生表型的改变, 这些结
果可能表明基因沉默与生长发育有共同的作用机制。但由于双链 dsRNA随生物体生长发
育或细胞分裂逐渐降解, 浓度下降使 RNA干扰作用逐渐失效, 不能稳定存在, 所以
RNAi 技术不利于发育晚期基因的研究。
4 问题与展望
RNAi 是基因功能研究的有力工具, 可用于研究动物繁殖过程中相关基因的调控
机制, 从而解决了体外研究基因功能的问题。但 RNAi 在该领域的研究中仍存在一定的
问题, 因为动物在体内的繁殖过程要受诸多因素的影响和调控, 其关系错综复杂, 而
RNAi 技术对生物体内含量丰富的靶基因抑制效果不是很高 , 并且目前 RNAi 机制尚未
完全阐明, 尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。尽管 RNAi 在动物繁殖领域仍存在
一定的问题, 但随着分子生物学的不断发展, RNA 干扰相关酶类的不断发现, RNAi 将
会普遍、高效地应用于动物的繁殖领域中。并且 RNAi 技术有望取代传统的基因抑制工
具, 成为动物繁殖领域中研究生殖细胞与胚胎发育的有效方法和手段, 应用于繁殖性能
候选基因功能的研究, 同时也为 RNAi 机制的确定具有重要意义。
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