发帖数: 1 | 1 大家好，
最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基因
克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
2. 用iScript转录cDNA.引物用的就是它家的random primer
结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败过
。用的是NEB家的Q5.
想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA. |
|
z*******o
发帖数: 1794 | 2 对于没有人做过的基因我倒是觉得直接从CDNA里面克隆比较好，直接合成都是基于网上
预测，我还真碰到过自己克隆出来的序列和网上预测不一致的情况。好好纯化一下你的
RNA，多换几对引物，只要不是特别大的基因应该没有问题。
[在 imacoolboy (imacoolboy) 的大作中提到：]
:大家好，
:最近通过qpcr检测到几个基因的表达在我们的实验条件下有变化。所以我想把这个基
因克隆出来。但这个基因实在是没人研究(是个LINC)，所以没人有它的cDNA.所以我想试
:试能否把它从cDNA克隆出来。我提取cDNA的办法是：
:1. 用RNAeasy提取细胞的RNA,没有用shredder
:结果今天做了PCR,什么band都没有，那个郁闷。。。我克隆也做了几年了，很少失败
过。用的是NEB家的Q5.
:想问一下大家，是我自己PCR条件没摸好，还是实验本身设计就行不通？我从来没做过
:自己提取cDNA然后再克隆gene的。以前都是从公司买现成的cDNA. |
|
T*****n
发帖数: 897 | 3 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: Tonyvan (Tony), 信区: Biology
标 题: 可以用cDNA样品残留的gDNA作为gDNA的来源吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jan 20 21:23:26 2012, 美东)
最近作基因测序。从cDNA 样品中测出了大部分的序列，只剩下5-6个小片段。于是基于
gDNA 设计了引物准备从gDNA中测序剩余的部分。做实验过程中发现我们的cDNA中有
gDNA 残留.于是做实验的过程中就将cDNA样品作为gDNA 来源，都得到了很好
的与预期大小一致的条带。现在老板发现了，大为不满。他认为是我不懂分子生物学。
我和他解释，但他怎么都不相信。我相信我的结果是对的，但我承认这不是标准的方法
。在实验过程中，有一个正常的对照标本，我加了cDNA和标准的gDNA样品。测序结果表
明两者是一致的。
即使如此，老板好像还是不相信。我该怎么办呢？大家在实验中走这种捷径吗? |
|
T*********y
发帖数: 643 | 4 我研究的基因有两个cDNA克隆，当我把它们和已知的来自于基因组的CDs比对时，发现
这两个cDNA克隆各有一个核苷酸的缺失，处于不同位置。我原来推测可能是cDNA克隆序
列不对，但后来测序其中一个cDNA克隆，证实确有一个氨基酸的缺失；当然也有其他的
突变，我推测是SNP。请问造成这种核苷酸缺失的原因是什么？ |
|
T*****n
发帖数: 897 | 5 最近作基因测序。从cDNA 样品中测出了大部分的序列，只剩下5-6个小片段。于是基于
gDNA 设计了引物准备从gDNA中测序剩余的部分。做实验过程中发现我们的cDNA中有
gDNA contamination.于是做实验的过程中就将cDNA样品作为gDNA 来源，都得到了很好
的与预期大小一致的条带。现在老板发现了，大为不满。他认为是我不懂分子生物学。
我和他解释，但他怎么都不相信。我相信我的结果是对的，但我承认这不是标准的方法
。在实验过程中，有一个正常的对照标本，我加了cDNA和标准的gDNA样品。测序结果表
明两者是一致的。
即使如此，老板好像还是不相信。我该怎么办呢？大家在实验中走这种捷径吗? |
|
I***W
发帖数: 218 | 6 如果一个human的cDNA sequence不能够在human genomic sequence上找到相应的位置，
说明什么？
我感兴趣的一个cDNA sequence，是从human的特定组织cDNA library sequencing得到
的，但是当我Blast这个cDNA找不到任何match的序列（对，是任何，包括human和其他
）。所以觉得很奇怪，是blast的问题，还是根本就是contanmination或者是Chimera
gene? |
|
c********u
发帖数: 250 | 7 俺手头有50多个基因要PCR拿到全长cDNA再用Gateway连GFP，请问用哪个公司的cDNA比
较好啊?
QUICK-Clone cDNA from Clontech asks for $526 for 20 rxn, similar product
from Biochain is only $259 for 40 rxn. Has anyone used the latter one?
Thank you. |
|
L******s
发帖数: 2349 | 8 和别的没比过，但相对于Taq、Vent之类，Phusion的效率绝对高的多。我从cDNA libra
ry里扩增某些gene的cDNA，taq做不出来的，换Phusion就全做出来了，而且cDNA libra
ry的用量可以减到用taq时的1/10，可能再低也行，不过没有去试。
RTp
但是 |
|
a*******u
发帖数: 2 | 9 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
|
b********2
发帖数: 125 | 10 多谢指点。现在还完全没有入门
克隆的那个基因序列和表达的蛋白序列是可以知道的，但是因为有内含子，所以考虑到
了cDNA.是说建立库是不必要，简单的方法就是用primer amplify想要的那段基因最直
接？那么建立cDNA库和得到一部分的cDNA在操作上有很大差别吗？ |
|
发帖数: 1 | 11 我是楼主。
谢谢楼上几位的建议。我现在有个疑问。是先把RNA用random hexamer转成cDNA，然后
在cDNA的基础上用PCR把基因克隆出来好？还是直接在RNA转cDNA的过程中，用克隆的引
物直接克隆出基因比较好？ |
|
b********r
发帖数: 9 | 12
how
1.extract the total mRNA
2.use restriction enzyme to cut out the desired gene
3.design a primer and do a PCR
4.Sequence the DNA and compare with those published sequences to see whether
it encodes the kind of enzyme you want.
5.Southern Blot to see whether pure and whether it is there.
6.Express the cDNA in Ecoli and check protein activity.
7.translate the sequenced cDNA to see whether you got the correct protein.
8.Sequence the expressed protein and back translate part of the AA's that has |
|
p******i
发帖数: 1092 | 13 多谢～
就是老板为了省钱不想买cDNA,自己动手克隆某一个cDNA...
提细胞的RNA，做RT-PCR，然后再PCR…… |
|
f*******e
发帖数: 354 | 14 买了个signosis的single cell real time PCR kit, 但是你面的东东实在太少了，做一
次预实验就消耗了不少，不知道大家有没有用另外的DNA polymerase, 不至于有CDNA但
是没有聚合酶做PCR啊
看了takara的 LA taq， EX taq，都是用来扩增长片段的，没有提到可以用于扩增非常
少的cDNA。
谁做过的推荐下，非常感谢！ |
|
|
e****p
发帖数: 354 | 16 要CLONE 一段CDNA 的重复序列片段，大概4K, 怎么PCR也P不出来，基因组上面这个物
种的这个位置是2个GAP
除了SCREEN CDNA library,请问有没有其他的办法？
谢谢！ |
|
e****p
发帖数: 354 | 17 请教SSCDNA TO DS CDNA 除了OD260 跑胶看看 有没有其他办法， |
|
b*******0
发帖数: 125 | 18 弱弱的问个白痴问题，qPCR 加 Master Mix（除cDNA）时 有没有必要换枪头呢？
我们做的是384孔板。买的是排枪，枪头价格不菲。加cDNA 肯定是换枪头的。但是加 Master Mix有没有必要换呢？有经验的讲讲 |
|
f*****f
发帖数: 195 | 19 rt-pcr检测只能说明对应的amplicon存在于你的cDNA中。你要克隆的基因多大？cDNA文
库是如何制备的？仅仅用普通逆转录出来的文库往往丰度不高，而且很多都转录不完全
或是只能得到一些基因的片段。假如基因比较大的话很难pcr出来 |
|
m******p
发帖数: 67 | 20 i have a sample, either total RNA or cDNA. anyone has a method to determine
whether it is RNA or cDNA?
Thanks |
|
b*****n
发帖数: 55 | 21 请问是否有合成的cDNA的kit，其产物可用于mir 和通常的 mRNA 的qRT-PCR？如果有是
哪一家公司的什么kit? 还是必须分别合成cDNA，以用于不同mir 或 mRNA 的qRT-PCR？
谢谢！！！ |
|
f****n
发帖数: 67 | 22 使用dsRNA注射昆虫进行RNAi，然后qPCR检测，
dsRNA高温变性后可以反转录成cDNA，
我提取total RNA后不高温变性，直接反转录成cDNA，
不知道注入昆虫体内的dsRNA，会不会影响qPCR的结果。 |
|
m****e
发帖数: 489 | 23 I have a set of variants that are listed according to their NM_xxxxx cDNA
sequence position. Do you know how to take these cDNA position values and
convert them to the corresponding GRCh37 genomic DNA coordinates? |
|
K**R
发帖数: 193 | 24 请教大牛们个问题，有一段基因cDNA 大概编码1200多个AA，predict的蛋白应该是
150KD.
为什么western条带大于200KD. 好几篇文章已经说这个条带是目的基因
我想问问呢大家，为什么条带差异这么大？ 为什么？是被转录后修饰？ 还是cDNA其实
是不完全的。可能有替换性拼接？
非常感谢！ |
|
K**R
发帖数: 193 | 25 我最近做反转录cDNA，上游引物设计在ATG上游附近，还是能扩增出条带。 我就是想问
问，在反转录过后5‘UTR一般情况下能被保留多少到cDNA里？
非常感谢！ |
|
K**R
发帖数: 193 | 26 问大家个问题，我最近设计一对引物，上游设计到ATG起始位点上游大概100bp， 下游
在exon里，
结果还是有条带。 我想问问，一般情况下，反转cDNA后，大概有多少5’UTR被包含在
反转的成熟cDNA里？
非常感谢 |
|
c***y
发帖数: 615 | 27 transcriptome analysis需要normalized cDNA吗？
通常什么情况下需要normalized cDNA?
多谢了！ |
|
H****s
发帖数: 301 | 28 如题，假设这个cDNA的序列完全不知道。cDNA是从mRNA逆转录来的，逆转录的时候用了
Oilgod(T)12-18做了逆转录引物。谢谢指点。 |
|
H****s
发帖数: 301 | 29 谢谢了。我收集有各种正常以及疾病组织的cDNA，有想法把他们做成全长的cDNA文库。
目前来看，只有给ssDNA加linker这个选择了。 |
|
x**e
发帖数: 163 | 30 正在做一个植物的cDNA文库构建，用的clontech的smarter infusion试剂盒，但是发现
infusion的效率极低，不知各位有没有用过这个试剂盒的经验？
另，后改用sfiI双酶切，企图连接到载体上，发现cDNA上的sfiI切点似乎也切不开，
sfiI位点序列是正确的，上到T载体上后仍然切不开。求问可能原因及如何解决？
有没有更合适的建库方法？
谢谢！ |
|
B***v
发帖数: 113 | 31 老板交代的任务。寻找cDNA的序列NCBI gene就可以吧？
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
我的感觉是很多不完整的序列在里面，鱼龙混杂，对一个不熟悉的基因很难分辨哪个序
列是对的。还有其他的更可靠的数据库查询cDNA序列吗？我只要找到不同物种的ORF即
可。
sequence alignment哪个软件比较好？或者是基于web的。最好是免费的，基本可以肯
定老板不会同意花钱买的。 |
|
a**********3
发帖数: 86 | 32 如题，我们在合成cDNA时通常需要按照所测算到的RNA浓度来换算所需RNA的量，在我们
最近的一次实验中，PCR产物电泳显示了实验组比对照组的条带的强度要强至少2倍，但
是实时PCR所算出来的表达强度仅仅为对照组的1.3倍，并不是很高。在考虑产生这个差
异的可能原因时，我们考虑到是否是由于我们仅仅将RNA的换算后的所需量的体积单位
精确到小数点后一位而不是两位导致的？希望有经验的各位老师指导。 |
|
E*********r
发帖数: 4984 | 33 我记得几年前Myriad Genetics跟美国专利局有一桩纠纷，美国专利局没有批准乳腺
癌的两个基因的Assay。现在有很多在做differential gene expression,然后找出一个
Biomarker Panel申请专利。 有人告诉我不能申请专利，因为基因是自然界存在的东西
。但是我看了美国专利局的解释，基因不能申请专利，但是cDNA是可以的，也就是说如
果从RNA入手，做出一个Biomarker Panel是可以申请专利的。专利是关于基因表
达的
不同，而不是基因本身。有熟悉这方面的大牛能够谈论一下？谢谢！ |
|
p****p
发帖数: 3360 | 34 Hi, there,
I'm a fruit fly people and want to order a human cDNA clone from either the
NIH_MGC_43 or NIH_MGC_114 library.
Where's the best place to order it?
Any information is appreciated. Thanks a lot in advance. |
|
D***a
发帖数: 516 | 35 一个cdna克隆几十块钱，何必呢？想想用掉的试剂和时间。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 36 前几天刚用invitrogen的5´ RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends, Version 2.0搞定一个13kb的RACE出来。
RNA质量很重要；要是只做反转录的话，invitrogen的SuperScriptTM Ⅲ First-Strand
Synthesis System可能更好；可以考虑在3'UTR位置多设计几条Gene Specific
Primers，效果比Oligo dT应该要好很多；多设计几条nested PCR引物，进行多轮扩增。 |
|
f*******e
发帖数: 354 | 37 我不是要扩增长片段 我只是要做single cell或极少量RNA RT来的PCR，就是常规的RTp
cr 但是模板量极少。kit里都有带的DNA polymerase 但是都非常少 很快就用完了 但是
还剩下很多的cDNA和RNA 用自己的普通taq酶好像不怎么灵 所以请教大家有没有用过什
么NB的酶 很多公司的牛酶都是宣称长片段 高保真 但是没有说高效率（灵敏）的 |
|
C***N
发帖数: 200 | 38 哪里可以查到编码限制性内切酶 cDNA 序列？打算AluI转到细胞里，切割多次重复的
AluI。大包子求助。 Thank you |
|
C***N
发帖数: 200 | 39 文章里没有AluI的cDNA序列。
那位达人知道吗？谢谢。 |
|
Y*Z
发帖数: 1301 | 40 本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
|
l*****g
发帖数: 43 | 41 想用knockin表达一个基因（不同种系），为什么有些人用genomic DNA（intron和exon
），而不是简单的full length cDNA？我不需要高表达，只要right amount， right
place。 |
|
l*****g
发帖数: 43 | 42 有。用人基因代替老鼠基因，3到4个exon。是公司做的，没看见发表文章
如果是转基因，什么时候用cDNA，什么时候用G DNA？什么考究呢？ |
|
n******u
发帖数: 418 | 43 大家推荐几个?
这些cDNA一般在什么vector上啊? |
|
j**W
发帖数: 89 | 44 这个addgene的lentiviral tet-on/off可以同时放shRNA和cDNA?有link吗?attL同时要
放在两个地方，怎么弄呢？ |
|
S******e
发帖数: 393 | 45 我是这样做的：从公司买的cDNA（这样可以保证质量），好像也不贵，
然后用pfu（pfu from invitrogen or NEB，记不清了，两家都用过），
扩了两个4kb,测序，然后拼接为8kb的片段。 |
|
c******r
发帖数: 3778 | 46 自己拼啊。
关键看你想干嘛。
如果想克隆出来慢慢玩儿，8kb，两段要是不行，分3段，4段怎么都可以了啊。不要用
random primer，用自己design几个primers也没多麻烦。顺利的话两个礼拜，不顺利一
两个月怎么也可以了。
如果需要很多samples拿来测序，一次扩也可以，但是要摸条件，RT需要调整protocol
，否则拿不到那么长的cDNA。慢慢试啦，不一定100%都可以成功，但是也不是不可能啦
。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 47 看不懂。你开头没测序怎么“发现”的？你的cDNA哪里来的？ |
|
T*********y
发帖数: 643 | 48 网上有提供的cDNA序列，从专门的resource center 买来的。和公布的genomic region
的序列比对，发现有one nucleotide deletion, 我买来后测序也确证有。 |
|
m*p
发帖数: 226 | 49 Nobody can be sure their cDNAs are 100% right, even published in the NCBI.
You are just not lucky. Put that one in, if you think it is a real deletion. |
|
m***c
发帖数: 177 | 50 What do you mean the 'CDNA 的重复序列片段'? |
|
