b**********8
发帖数: 349 | 1 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
实在没办法，把以前shRNA的序列发给Dharmacon公司，让他们合成siRNA,然后又能重复
到以前的现象。
我现在怀疑前面的A调节B的发现很可能是shRNA的脱靶效应。因为我用新的siRNA（就是
和shRNA序列一样的那个）做了很多机制方面的研究，包括B基因启动子的报告基因实验
，组蛋白乙酰化和甲基化修饰，DNA甲基化等都是阴性。老板是AP，压力大，老嫌我进
度慢，由于长期对我的结果不满意，现在都不怎么礼拜我，严重缺少交流。
已经快崩溃了，请版里的大侠支招啊，谈谈这个课题还能怎么做下去，谢谢了 |
j****x
发帖数: 1704 | 2 确实棘手。。。
如果在A已经几乎被100% knockdown的情况下无法观察到针对B的效应，那么A对B的调控
几乎可以被排除了，显然siRNA off-target效应是很可能的解释之一。
能不能不用siRNA pool，分别转染单个siRNA，看看能不能找出问题出来哪个siRNA上 |
F*******2
发帖数: 103 | 3 不管你们做siRNA, 还是shRNA, 不做rescue control吗？如果脱靶的话，你再
introduce wt A基因的话，B下调的phenotype是不能回复的 |
o**4
发帖数: 35028 | 4 建议做rescue，看看B的表达在shRNA之后能不能恢复
【在 b**********8 的大作中提到】
: 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
: 废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
: 一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
: 因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
: 胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
: 我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
: 老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
: siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
: 几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
: 从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
|
b**********8
发帖数: 349 | 5 多谢楼上各位的建议，rescue的实验我们确实还没做过。今天又想向大家反应点新情况
，如下：
当初shRNA敲除A的时候，B基因在mRNA和protein水平都有显著下调。如前文所述，包括
B基因启动子的报告基因实验，组蛋白乙酰化和甲基化修饰，DNA甲基化等都是阴性结果
。后来实在没办法了，和别的组里的人讨论了下，觉得是否有可能A通过维持B基因转录
产物的稳定性，于是我又做了这个实验，转染A基因的siRNA后，等待48小时，再向
medium中加入Actinomycin D,每隔4小时收集细胞提取RNA,分别收集0,4,8,12小时，每
次3个wells，然后做realtime RT-PCR，结果在两个细胞株中发现siRNA组细胞中B基因
mRNA降解的比siCONTROL更快，但是在另外两个细胞株里没有观察到这种分别。现在又
出现几个问题：
1）观察到分别得那两个细胞株里，48小时候（即加药的第0小时），A基因的knockdown
效率只有50%。而在另外两个没有分别的细胞株里，48小时的沉默效率却有80%，老板觉
得即使mRNA降解实验阳性，很有可能是artifact，认为我的数据不可信，然后又要我重
复。不过我发誓数据绝对是真实的，没有经过任何人为地modification。
2）因为当初观察到mRNA稳定性上的差别，所以老板让我做做B基因3'UTR的报告基因实
验，我把3'UTR克隆到pMir-Reporter vector的多克隆位点，然后转染细胞株，结果却
发现siRNA和siCONTROL相比没有分别。我想问，除了3'UTR，还有哪些因素影响mRNA的
稳定性呢？如果有，有分别可以做哪些实验验证呢？
不好意思，小弟不是生物学科班出身，以前是学临床的，出来读PhD也是曲线救国，很
多基础的东西不是太明白。另外我嘴笨，文笔不好，描述的可能有点乱，恳请大家给我
指点迷津，非常感谢~ |
y******u
发帖数: 246 | 6 我是学工程+bioengineering，只是随便分析分析：
现在知道的是：
shRNA A knockdown = B 表达水平下降
siRNA A knockdown 100% = B 没影响
siRNA A knockdown 80% = B 没影响
siRNA A knockdown 50% = B 降解加速
如果rescue无法排除脱靶的话，
你试一试siRNA A knockdown 30%和10%，看看吧。。。 |
h*****4
发帖数: 1158 | 7 没rescue出来之前不要做太多阿，这是最基本的control阿，
谁知道那么大量的shRNA会引起啥变化
难道你师姐前一篇快接受的文章没有这个rescue试验？ |
b**********8
发帖数: 349 | 8 发信人: hffmsb4 (Hong), 信区: Biology
标 题: Re: 大家有没有经历过这种情况？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Mar 5 02:33:15 2011, 美东)
没rescue出来之前不要做太多阿，这是最基本的control阿，
谁知道那么大量的shRNA会引起啥变化
难道你师姐前一篇快接受的文章没有这个rescue试验？
多谢你的建议，我们确实还没有做过这个rescue的实验。但是我现在最想知道的是，影
响mRNA stability的因素当中，除了3’UTR，还有那些因素，分别可以用什么实验方法
来验证，请各位献言献策吧。多谢了 |
b*****l
发帖数: 9499 | 9 正如大家说的，重点肯定还是 rescue 了，而且也不难做，有这折腾的时间说不定早就
做出来了。
不过我好奇哈：shRNA 是你师姐做的，但是你重复过没有？
另外，老板说 artifacts 不是说怀疑你 modify data。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
: 废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
: 一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
: 因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
: 胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
: 我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
: 老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
: siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
: 几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
: 从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
|
b**********8
发帖数: 349 | 10
重复过的，我来之后也一直用shRNA处理细胞并陆续进行下游的一些实验。后来因为要
做ChIP,需要的shRNA量太大，我们都是自己包装纯化慢病毒的，不能满足我试验的需要
，索性就买了siRNA回来，在optimize条件的时候发现的这个问题。
那我想问下，这个rescue的实验该如何做呢？我们之前都是在转导慢病毒shRNA后第四
天收细胞进行各种实验的，对B基因的抑制可以在第3天到第7天观察得到，更短或者更
长的时间我们没做过。
【在 b*****l 的大作中提到】
: 正如大家说的，重点肯定还是 rescue 了，而且也不难做，有这折腾的时间说不定早就
: 做出来了。
: 不过我好奇哈：shRNA 是你师姐做的，但是你重复过没有？
: 另外，老板说 artifacts 不是说怀疑你 modify data。
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y***i
发帖数: 11639 | 11 这个主意不好。
【在 y******u 的大作中提到】
: 我是学工程+bioengineering，只是随便分析分析：
: 现在知道的是：
: shRNA A knockdown = B 表达水平下降
: siRNA A knockdown 100% = B 没影响
: siRNA A knockdown 80% = B 没影响
: siRNA A knockdown 50% = B 降解加速
: 如果rescue无法排除脱靶的话，
: 你试一试siRNA A knockdown 30%和10%，看看吧。。。
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a***e
发帖数: 1010 | 12 design two shRNA, could you get the same phenotype? |
b**********8
发帖数: 349 | 13
当初确实设计了不同序列的两对shRNA,结果一样，只不过其中一对更为profound。这样
的话是不是可以排除shRNA的脱靶效应。
我后来比较了一下，两队shRNA分别target A基因的第1和第4个exon，后来买的
smartpool siRNA,其中两条也是target这两个exon，还有两条target 更靠近3'端，其
中好像有一条还target到3’UTR（记不清了），请问这个有什么影响吗？
【在 a***e 的大作中提到】
: design two shRNA, could you get the same phenotype?
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b*****l
发帖数: 9499 | 14 做过 A 的 k/o 么？
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 当初确实设计了不同序列的两对shRNA,结果一样，只不过其中一对更为profound。这样
: 的话是不是可以排除shRNA的脱靶效应。
: 我后来比较了一下，两队shRNA分别target A基因的第1和第4个exon，后来买的
: smartpool siRNA,其中两条也是target这两个exon，还有两条target 更靠近3'端，其
: 中好像有一条还target到3’UTR（记不清了），请问这个有什么影响吗？
|
s******y
发帖数: 28562 | 15 听起来你其实已经作了很多工作了。
我建议你勤向老板汇报，不管是正面数据还是负面数据都应该向老板报告。
（除非是自己出了错跑错胶填错数据之类的错误，这种就要尽量不要让他知道）
对于负面数据，虚心的（或者是装着虚心的）向老板请教下一步该怎么做。
至于你们那个数据到底是怎么回事，我觉得脱靶是很有可能的，但是这个其实
并不会影响你们的那个项目，也应该不会影响你的师姐的文章，相反，万一
审稿者提出这个问题来的时候，你的数据就有用了。
我建议你把结果向老板报告，不要自己闷着头作。
我自己学习到的一点是：负面数据不一定都是坏事。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
: 废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
: 一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
: 因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
: 胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
: 我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
: 老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
: siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
: 几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
: 从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
|
d****u
发帖数: 1553 | 16 同学，先把rescue实验做了吧，这是最重要的。还有一点就是你怎么确定你自己的
siRNA产生的抑制不是off target的效应呢？ |
j********r
发帖数: 156 | 17 如果楼主感兴趣，以后可以尝试make stable tet-on shRNA in the target cells。比
如novartis的tet-on pLKO，最近Steve Elledge也做了一个inducible shRNA vector (
based on miR30). |
M*****n
发帖数: 16729 | 18 rescue是一种control.
楼主用不同的siRNA targeting同一个基因，也是一种control。
unfortunately this control did not give positive results.
therefore, the initial conclusion that the regulation of B is dependent on A
should be rejected at this point. |
y***i
发帖数: 11639 | 19 "也应该不会影响你的师姐的文章" 怎么可能？
发现
个基
癌细
要由
了后
效率
果，
后来
【在 s******y 的大作中提到】
: 听起来你其实已经作了很多工作了。
: 我建议你勤向老板汇报，不管是正面数据还是负面数据都应该向老板报告。
: （除非是自己出了错跑错胶填错数据之类的错误，这种就要尽量不要让他知道）
: 对于负面数据，虚心的（或者是装着虚心的）向老板请教下一步该怎么做。
: 至于你们那个数据到底是怎么回事，我觉得脱靶是很有可能的，但是这个其实
: 并不会影响你们的那个项目，也应该不会影响你的师姐的文章，相反，万一
: 审稿者提出这个问题来的时候，你的数据就有用了。
: 我建议你把结果向老板报告，不要自己闷着头作。
: 我自己学习到的一点是：负面数据不一定都是坏事。
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s******y
发帖数: 28562 | 20 等他的结果核实的时候，他的师姐的文章可能都已经出版了。
弄不好还能再发一篇文章，实验室自己更正自己的文章还是有先例的吧？
【在 y***i 的大作中提到】
: "也应该不会影响你的师姐的文章" 怎么可能？
:
: 发现
: 个基
: 癌细
: 要由
: 了后
: 效率
: 果，
: 后来
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p*****m
发帖数: 7030 | 21 要我说 一个连rescue都没有的RNAi实验如果能过reviewer这关 这杂志得有多水啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 等他的结果核实的时候，他的师姐的文章可能都已经出版了。
: 弄不好还能再发一篇文章，实验室自己更正自己的文章还是有先例的吧？
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s******y
发帖数: 28562 | 22 所以这个实验本来就是早晚都要做的嘛。
另外，你还真别说，我就看过好多篇没有rescue 的文章，我们做journal club
时不时就能读到这样的文章，而且还是JCB 以上的级别的。估计老板够牛，审稿
人不敢多嘴或者主编放水。
再另外，有些蛋白是很难做rescue的，因为弄进一个fusion 之后常常会出问题，
或者是没有料到5', 3'-UTR有些意料之外的功能，表达进去的recombinant 没有
办法fully rescue
【在 p*****m 的大作中提到】
: 要我说 一个连rescue都没有的RNAi实验如果能过reviewer这关 这杂志得有多水啊
|
p*****m
发帖数: 7030 | 23 没rescue的话是不是至少得有个scrambled RNAi或者multiple targeting construct一
起用才行？ 其实按lz这个说法 如果真是off target，当时多用几个shRNA的话应该就
能看出来吧
。
【在 s******y 的大作中提到】
: 所以这个实验本来就是早晚都要做的嘛。
: 另外，你还真别说，我就看过好多篇没有rescue 的文章，我们做journal club
: 时不时就能读到这样的文章，而且还是JCB 以上的级别的。估计老板够牛，审稿
: 人不敢多嘴或者主编放水。
: 再另外，有些蛋白是很难做rescue的，因为弄进一个fusion 之后常常会出问题，
: 或者是没有料到5', 3'-UTR有些意料之外的功能，表达进去的recombinant 没有
: 办法fully rescue
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s******y
发帖数: 28562 | 24 scrambled RNAi一般是必须作的吧，而且很多时候那个是厂家配送的，一般人
会顺手就做了。
另外，看样子，他的师姐当时没有用足够多的不同的shRNA, 所以他现在用了
另外一个不同的shRNA mixture就得出了不同的结论。
但是，现在还有一个问题是，他自己用的shRNA mixture 未必就是最好的，
说不定是因为他用的那个mixture有off target, 才导致了他的结论不一样。
在这种情况下，我也赞成你们的意见，就是先做一个rescue试试看。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 没rescue的话是不是至少得有个scrambled RNAi或者multiple targeting construct一
: 起用才行？ 其实按lz这个说法 如果真是off target，当时多用几个shRNA的话应该就
: 能看出来吧
: 。
|
p*****m
发帖数: 7030 | 25 他自己的当然不一定好 但是问题是他的siRNA导致了A下调 但是B没有反应。因此唯一
能解释原来model(A-->B)的可能就是他的siRNA mix一方面downregulate A，一方面
siRNA还有off-target effect，弄掉了某个B的regulatory gene，使得B没有显示出A下
降之后预期的变化。这个未免也太不可能了。。
【在 s******y 的大作中提到】
: scrambled RNAi一般是必须作的吧，而且很多时候那个是厂家配送的，一般人
: 会顺手就做了。
: 另外，看样子，他的师姐当时没有用足够多的不同的shRNA, 所以他现在用了
: 另外一个不同的shRNA mixture就得出了不同的结论。
: 但是，现在还有一个问题是，他自己用的shRNA mixture 未必就是最好的，
: 说不定是因为他用的那个mixture有off target, 才导致了他的结论不一样。
: 在这种情况下，我也赞成你们的意见，就是先做一个rescue试试看。
|
b**********8
发帖数: 349 | 26 谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我
看了一些关于mRNA stability方面的文献，发现影响mRNA stability的因素太多了，这
样的话我的课题又陷入了一个新的寻找机制的汪洋大海，岂不悲哉？ |
b*****l
发帖数: 9499 | 27 唉，也见过一些。读的时候不怀好意地想：肯定是 rescue 没成功。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 要我说 一个连rescue都没有的RNAi实验如果能过reviewer这关 这杂志得有多水啊
|
b**********8
发帖数: 349 | 28
多谢关注，我们每个实验都有同时使用scrambled control的
【在 p*****m 的大作中提到】
: 没rescue的话是不是至少得有个scrambled RNAi或者multiple targeting construct一
: 起用才行？ 其实按lz这个说法 如果真是off target，当时多用几个shRNA的话应该就
: 能看出来吧
: 。
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p*****m
发帖数: 7030 | 29 multiple shRNA呢？
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 多谢关注，我们每个实验都有同时使用scrambled control的
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b*****l
发帖数: 9499 | 30 对了，忘了问了：shRNA k/d A 后，测没测过 A 和 B 的 mRNA 的稳定性？shRNA 要是
off-target 到了 B 上，也许可以看出来。
UTR
【在 b**********8 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
: 不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
: 达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
: 建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
: system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
: 个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
: 扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
: 半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
: 的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
: 这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我
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b**********8
发帖数: 349 | 31
不明白，什么是multiple shRNA?
我们以前用shRNA的时候一般这样分组：wt，shcontrol，shRNA1，shRNA2
现在用siRNA，只分三组，wt，scramble，siRNA
【在 p*****m 的大作中提到】
: multiple shRNA呢？
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b**********8
发帖数: 349 | 32
没有，后续的机制探索一直都用siRNA处理细胞，很久不再用shRNA了。有必要再用回
shRNA处理细胞再检测mRNA的半衰期吗？谢谢
【在 b*****l 的大作中提到】
: 对了，忘了问了：shRNA k/d A 后，测没测过 A 和 B 的 mRNA 的稳定性？shRNA 要是
: off-target 到了 B 上，也许可以看出来。
:
: UTR
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b*****l
发帖数: 9499 | 33 不麻烦的话就做做呗。。。估计 reviewer 也可能会让你们做。。。
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 没有，后续的机制探索一直都用siRNA处理细胞，很久不再用shRNA了。有必要再用回
: shRNA处理细胞再检测mRNA的半衰期吗？谢谢
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s******y
发帖数: 28562 | 34
UTR
3'-UTR并不一定就是决定稳定性的所有因素，在一些情况下面，5'甚至ORF都有关系。
我虽然具体不是做这个的，但是，我觉得，你可以把那个 mRNA里面的ATG位点去掉
（这样它就不表达你们那个蛋白了），然后就可以把蛋白和 mRNA的效应分开了。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
: 不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
: 达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
: 建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
: system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
: 个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
: 扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
: 半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
: 的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
: 这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我
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s******y
发帖数: 28562 | 35 这个不一定的，因为他们原先的模型( A -> B)过于简单了。其中说不定会涉及其他
因子，而其他因子说不定会受off target 的影响。
比方说，A-> c -> B, 如果c 受到影响，则整个链条不成立
【在 p*****m 的大作中提到】
: 他自己的当然不一定好 但是问题是他的siRNA导致了A下调 但是B没有反应。因此唯一
: 能解释原来model(A-->B)的可能就是他的siRNA mix一方面downregulate A，一方面
: siRNA还有off-target effect，弄掉了某个B的regulatory gene，使得B没有显示出A下
: 降之后预期的变化。这个未免也太不可能了。。
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