J*******6
发帖数: 72 | 1 问个有关mRNA therapy 的问题。mRNA可以直接用脂质体转染用于治疗。但是，如果
mRNA半降解，不是全长的mRNA， 这些mRNA是否有可能表达非全长的蛋白？或多肽？
我的理解是由于没有了stop coden, 没有 polyAAA, 蛋白就不能表达了。 |
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m****g
发帖数: 530 | 2 【 以下文字转载自 Harvard_Medical_School 俱乐部 】
发信人: macdog (dog), 信区: Harvard_Medical_School
标 题: mRNA的末端或能预防癌症的发生
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Aug 26 21:38:03 2009, 美东)
mRNA的末端区域通常被认为是无足轻重的，但是有研究表明，这个区域实际上可能承担
着预防正常细胞转变成癌细胞的重要责任。这项研究结果发布在8月20日的《cell》上。
蛋白质是由细胞DNA的模板生成的。这种模板叫信使RNAs（messenger RNAs，mRNAs），
它包含三个区域。中间区域是编码蛋白的，起始端和末端是非翻译区（UTRs），因为它
们不能编码蛋白的任何部分。起始端能够促使蛋白质翻译开始，而尾部，即3'UTR，似
乎只是简单的跟随而已。所以mRNA的末端经常被认为是不重要的。
文章的第一作者Christine Mayr解释说，目前我们已经证实通常mRNA末端有一个蛋白质
翻译调控程序，而且在某些情况下对癌症的发生具有重要作用。
几乎所有的生物过程细胞都需要利用蛋白质 |
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c****1
发帖数: 1095 | 3 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
不知道我说明白没有。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 4 和原核mRNA不一样，真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则，所以同一条mRNA翻译
出不同的产物很常见（即使不存在IRES的情况下），尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
首先检查一下，你这2个AUG，是否都符合Kozak consensus规则，简言之如果-3位为A且
/或+4位为G的话，那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大，这样的AUG如果在5'UTR 区
域中存在甚至还不止一个的话，那么自然对正常的ORF翻译有竞争性（核糖体）的副作
用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 5 估计你做的这个gene甚至物种是没有已知的基因组序列信息的吧，否则你也就不会费劲
做RACE了。
把你的编码产物比对一下近缘物种的基因组序列（如果有全长cDNA序列当然最好），蛋
白质的N端往往是比较保守的，根据近缘物种的ortholog可以很大程度上帮助你确定5'
端起始位点。
如果你确定你拿到了完整的5'端序列（包含UTR），那么根据Kozak规则，ORF里第一个
符合Kozak规则的ATG就很大可能是起始ATG。真核mRNA不同于原核mRNA，基本不存在什
么RBS序列的概念，5' mG cap就是核糖体识别和结合的位点，然后往下游移动遇到合适
的ATG就开始翻译了（至少我当年上医学分子生物学的时候老师是什么说的，呵呵）
如果你不确定你是否获得了完整的mRNA 5'序列，那么继续吧，至少先通过NB等方法确
定一下可能有几个转录本，最长的转录本有多大。因为alternative splicing等等因素
的存在，一个基因存在多个翻译起始位点确实很常见，这也是基因表达调控的一种重要
方式了，遇到这种情况，你可能需要在5' RACE的引物设计上下点心思，用来区别不同
的mRNA产物。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 6 转录的起始位点：
如果有TATA BOX, 很可能是single transcription start site，
但是大多数真核gene都没有TATA BOX，所以都是有好几个TSS clusters，每个TSS
cluster里面的TSS们大概在200bp这么大的范围之内
如果有几个相聚较远的TSS cluster，那么这个gene有可能有不同的mRNA species，但
是还是要做实验去验证
是不是应该针对每一个mRNA species，再单独考虑start codon 的问题？
however... 貌似很多gene都有不同的mRNA species，但是不一定这些mRNA species都
有功能，更不一定都会translate成蛋白
你说你的目的是得到一个蛋白的short form，
你expect short form和wild type的区别是什么？
after all, if there is nothing new about this short form, you cannot publish
, right?
是不是可以把可能的short form的ORF... 阅读全帖 |
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f*******e
发帖数: 354 | 7 求教：
手里研究的A蛋白影响了B蛋白的蛋白水平，但不影响mrna水平，本想做降解的，MG132
虽然可以恢复一部分，但是就是内源性降解曲线（CHX）没有明显差异。现在想要不要
转向翻译水平，但是没有full length 的mrna，只有coding区，因为也不知道是否在非
编码区的调控，所以单独试coding区意义不大。
所以如下假设，不知道有没有可能。
先将原核表达纯化的蛋白（如GST和GST-A）加入到IVT系统中，再加入相同ug的细胞
total mRNA,翻译一定时间后Western检测B蛋白，不知道这样是否可能，有没有达人做
过，一般都是特定的mrna，这样总rna会不会目的基因拷贝数太少而检测不到。
非常感谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 8
特例当然是有的，但是那个就是“特例”。 mRNA的主要目的是用来做蛋白的，所以在
进化上他们的结构是受限制的，尤其是受核糖体限制。总体而言，mRNA
的coding region的结构比较flexible，不然就不容易让核糖体read through。
所以mRNA 的regulatory elements大多是在3' end, 在5' end 的则大多数是
调节核糖体的结合与组装效率的，在coding region 的则很少。
至于lncRNA, 大家的了解都还不多。但一般而言，应该是有结构或者adapter,
甚至是酶功能的。它们因为不用来做translation, 所以在进化上并不受核糖体的
限制，而是受它们的结合partner的限制，所以和mRNA会有很大的不同。 |
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发帖数: 1 | 9 在基因的内含子上面加入一个poly(A)会影响其pre-mRNA和mature-mRNA的
transcription和translation吗？
会不会发生pre-mRNA在转录到poly（A)的位置就停止了，还是会继续转录，然后在mRNA
的成熟加工过程中被切掉，基因的翻译不受任何影响？ |
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发帖数: 1 | 10 Terminators in eukaryotes[edit]
In eukaryotic transcription of mRNAs, terminator signals are recognized by
protein factors that are associated with the RNA polymerase II and which
trigger the termination process. Once the poly-A signals are transcribed
into the mRNA, the proteins cleavage and polyadenylation specificity factor
(CPSF) and cleavage stimulation factor (CstF) transfer from the carboxyl
terminal domain of RNA polymerase II to the poly-A signal. These two factors
then recruit other pr... 阅读全帖 |
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m****g
发帖数: 530 | 11 mRNA的末端区域通常被认为是无足轻重的，但是有研究表明，这个区域实际上可能承担
着预防正常细胞转变成癌细胞的重要责任。这项研究结果发布在8月20日的《cell》上。
蛋白质是由细胞DNA的模板生成的。这种模板叫信使RNAs（messenger RNAs，mRNAs），
它包含三个区域。中间区域是编码蛋白的，起始端和末端是非翻译区（UTRs），因为它
们不能编码蛋白的任何部分。起始端能够促使蛋白质翻译开始，而尾部，即3'UTR，似
乎只是简单的跟随而已。所以mRNA的末端经常被认为是不重要的。
文章的第一作者Christine Mayr解释说，目前我们已经证实通常mRNA末端有一个蛋白质
翻译调控程序，而且在某些情况下对癌症的发生具有重要作用。
几乎所有的生物过程细胞都需要利用蛋白质，从细胞分裂，到转运一些机体必不可少的
分子，到维持细胞结构等等。由于细胞的蛋白产生是受严格调控的，不同的细胞类型产
生的蛋白也是不一样的。如果在细胞的生命周期中蛋白的供应过量或不足就会改变细胞
正常的功能。而这些改变可以导致细胞无限生长和转移，而这两者正符合了癌细胞的特
征定义。
通过比较正常细胞和癌细胞 |
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e********r
发帖数: 147 | 12 目前我们基本证明一个调控蛋白不调控下游基因的转录，不影响mRNA的稳定性，也不影
响蛋白的稳定性，基本确定是在翻译水平调控下游基因翻译蛋白的量。
这样的话，是不是影响翻译效率的因素都要考虑一遍（比如mRNA二级结构、ribosome
binding, 延伸、终止......）？这样检测的东西也太多了吧！在做更精细的生化分析
之前，一般有没有什么比较好的遗传或其它方法可以先试一下？至少做几个有建设性提
示的粗糙实验？
另外查了一下，以前检测ribosome binding要先提取ribosome亚基，然后用引物延伸一
类的方法来检测与mRNA的binding，现在还这么干吗？感觉还是太复杂了一些。
先行感谢兄弟们的建议！ |
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a***e
发帖数: 1010 | 13 during RT, the template mRNA can be degraded if the reverse
transcriptase harbors RNase H activity. Thus, one mRNA molecular only
generates one cDNA.
However, an internal control is still very important to normalize the
amount of your input mRNA. Thus, including several different house
keeping genes as internal controls is still necessary. |
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l******n
发帖数: 105 | 14 原来觉得即使做了mRNA表达谱也还是会漏掉这个microRNA的direct target中的很大一
部分（比如某个micrRNA有300个target，mRNA表达谱检测只能找到100个，漏掉200个）。
而现在看来mRNA表达谱会找到这个microRNA的几乎全部direct target（比如找到300个
target中的270个）。这样RNA-Seq就足够了。
而且RNA-Seq比SILAC这种Proteomics的方法成本便宜太多了，很多实验室都用得起。 |
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E****A
发帖数: 184 | 15 多谢你的见解。
刚才在wiki里看到你说的Kozak consensus是(gcc)gccRccAUGG，R可以是A也可以是G。
查了下两个AUG都符合。你说对正常的ORF有竞争性是指下游的ORF不会被翻译还是翻译
会变弱？
其实我刚开始的帖子里没有完全说出来，在1st exon和2nd exon中间有个alternative
first exon。这个alternative first exon所属的mRNA只有在2nd exon上有AUG，这个
2nd exon和上面那条mRNA的2nd exon是一样的。这么说，1st exon上的AUG会对这条
alternative 1st exon所属的mRNA的翻译产生抑制作用？有文章说明这种抑制作用的强
弱吗？
多谢。
遍。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 16 如题，影响mRNA稳定性的因素有哪些？这些因素是否一定通过3'UTR发挥作用？我知道
的比如说RNA结合蛋白HuR,alphaCP1等，以及miRNA等都是通过影响3'UTR的活性来影响
mRNA的稳定性，除了这些还有哪些因素呢？尤其是非3'UTR相关的，另外，如果有其他
机制，又可以通过怎样的实验检验这些机制是否参与调控mRNA稳定性？
请版里的大牛们献言献策吧，你的建议和意见都可能会帮助到我的project，或者提供
些相关的文献给我也好，非常感谢 |
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V***b
发帖数: 3419 | 17 我用的是cycloheximide，24小时细胞就死了50%（浮起来了），如果这样的话我这实验
不可能延续2-3天。我用了500 uM，但是看文章里有人用150 uM，有人用50 uM，还有人
用8 uM，差别很大，我现在不知道抑制mRNA翻译，cycloheximide浓度该用多少，另外
我的细胞死亡是因为mRNA翻译被抑制了还是因为非特异性毒性（我用的浓度太高了）。
另：专门搞翻译的人总是强调那是mRNA翻译，不是蛋白质翻译，但平时交流，说蛋白质
翻译的占大多数，他们很不满。到底应该叫什么？还是无所谓？ |
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V***b
发帖数: 3419 | 18 我用的是cycloheximide，24小时细胞就死了50%（浮起来了），如果这样的话我这实验
不可能延续2-3天。我用了500 uM，但是看文章里有人用150 uM，有人用50 uM，还有人
用8 uM，差别很大，我现在不知道抑制mRNA翻译，cycloheximide浓度该用多少，另外
我的细胞死亡是因为mRNA翻译被抑制了还是因为非特异性毒性（我用的浓度太高了）。
另：专门搞翻译的人总是强调那是mRNA翻译，不是蛋白质翻译，但平时交流，说蛋白质
翻译的占大多数，他们很不满。到底应该叫什么？还是无所谓？ |
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w***y
发帖数: 493 | 19 我现在正在尝试从zebrafish embryo的total RNA里面提取mRNA， 用的是invitrogen的
Dynabeads和他们的mRNA purification kit。 按照他们的protocol做完后跑胶发现里
面还是有挺多rRNA。上网搜了一下发现有的人建议连续做2次protocol里说的
purification。 请问大家有什么建议么？
我试了一下发现第1次纯化后获得了大概3.8%的total RNA。第二次以后有1.5%的total
RNA。我不太确定这样连续2次purification会不会损失太多mRNA。 |
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w***y
发帖数: 493 | 20 谢谢， 我只想要mRNA，因为我要去做mRNA-seq, 所以要去掉rRNA。 我看了rRNA-zero
kit，发现这是用在Human/Mouse/Rat上的， 似乎不能确定是否能用在zebrafish上，在
网上搜到有人说在鱼里效果不怎么样。 请问你是用在鱼里么？另外这个kit会不会导致mRNA的丢失呢？
about 5ug and ends up with 150- |
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l**********1
发帖数: 5204 | 21 alternatively you can try Oligotex-dt30 mRNA purification kit for total RNA
sample:
Manual book:
//catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/NTrap%20mRNA_j.pdf
Vender link:
//www.mn-net.com/Products/DNAandRNApurification/RNA/NucleoTrapmRNA/tabid/1328/language/en-
US/Default.aspx
Reference:
please go to
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18678863
T Yabu - 2008 JBC
31 Oct 2008 – In zebrafish embryonic cells, the endogenous SMase enzyme was
.... using the Oligotex-dt30 mRNA purification kit (Tak... 阅读全帖 |
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D*******A
发帖数: 60 | 22 I tried to deplete tRNA from yeast mRNA using two Ambion kits: MirVana which
seperates small RNA and large RNA and poly(S)purist which purify the mRNA.
However, I found a big amount of tRNA contamination in mRNA. In my
experiment, I wish the tRNA amount the less the better. Please give your
suggestions! Thanks! |
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h*******l
发帖数: 16 | 23 预计某药物应该抑制某基因的TRANSCRIPTON的，但实验结果测了STEADY STATE mRNA没
有显著差异，现在要测新合成的mRNA,不知道有些什么方法可以用啊？谢谢！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 24 Plant
There is reason to think that mRNA degradation sometimes starts with the
action of ribonuclease III, an enzyme specific for duplex RNA, which could
cleave in stem-loop structures and create sites for exonucleolytic attack.
RNase III is actually involved in the maturation of certain phage mRNAs as
they undergo posttranscriptional processing, but this involvement is not
known to occur with bacterial mRNAs.
PMID 17693527
Watkins KP et al.
A ribonuclease III domain protein functions in group I... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 25 CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
bGH PolyA signal
mammalian terminators (SV40, hGH, BGH, and rbGlob) include the sequence
motif AAUAAA which promotes both polyadenylation and termination. Out of
those listed, the SV40 late polyA and rbGlob polyA are thought to be more
efficient in terminating transcripti... 阅读全帖 |
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C*****e
发帖数: 17 | 26 the best kit so far: RISO from Genemed Inc.(www.genemed.com). It can extract
total RNA from nanogram scale tissues. Then you can use mRNA extraction kit
from QIAgen to get mRNA.
I did hundreds of times. Results are neat and steady.
guy |
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l*********i
发帖数: 332 | 27 从mRNA说起
其实这真是个挂样头买狗肉的题目。我是并不从mRNA说起。
我要从学习记忆的研究说起。学习记忆，多么令人着迷的话题。我决定这辈子
就整这个了
。
1970年，学习记忆的研究机制取得重大突破。那是其实也一直到现在，最根本
的问题就是
，外界的信息是怎样传到大脑，并巩固下来？
那个时候基因热啊，因为分子生物学正在狂飚期。所以很容易进行一个简单的
假设，外界
的信息传到大脑，诱导了多种基因的表达（那是monod和jacob的模型也刚刚出
现），然后
巩固了神经连接，或者储存某种物质？蛋白质？那时候还只知道蛋白质呢。
好，如果这个模型成立，如果人为阻断基因的转录和蛋白质的合成，就应该能
对记忆的形
成和巩固产生影响！
Larry Squire，现在在UCSD，分别用转录抑制剂Actinomycin-D和翻译抑制剂
Cycloheximi
de，发现都能够对记忆产生这样那样的影响。一下子，对学习记忆机制的了解
前进了一大
步。
请注意，这里并没有区分究竟是转录调控重要还是翻译调控更重要。
然后Larry Squire有搞清楚了海马是记忆的核心区域，他不得个Nobel实在是
亏啊。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 28 ☆─────────────────────────────────────☆
lanceandfei (La Jolla的云彩) 于 (Tue Jan 23 19:10:22 2007) 提到:
从mRNA说起，修订版
其实这真是个挂样头买狗肉的题目。我是并不从mRNA说起。
我要从学习记忆的研究说起。学习记忆，多么令人着迷的话题。我决定这辈子
就整这个了。
1970年，学习记忆的研究机制取得重大突破。那是其实也一直到现在，最根本
的问题就是，外界的信息是
怎样传到大脑，并巩固下来？
那个时候基因热啊，因为分子生物学正在狂飚期。所以很容易进行一个简单的
假设，外界的信息传到大
脑，诱导了多种基因的表达（那是monod和jacob的模型也刚刚出现），然后巩固了神经
连接，或者储存某种物
质？蛋白质？那时候还只知道蛋白质呢。
好，如果这个模型成立，如果人为阻断基因的转录和蛋白质的合成，就应该能
对记忆的形成和巩固产生影
响！
Larry Squire，现在在UCSD，分别用转录抑制剂Actinomycin-D和翻译抑制剂
Cycloheximide，发现都
能够对记忆产生这样那 |
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e********r
发帖数: 147 | 29 在体外条件下，研究核糖体小亚基与mRNA的结合可以用ribosome toeprinting assays
这一类的方法。但在我们的研究体系里，由于调控因素可能较多，体外实验体系分析不
一定能够重现细胞内的条件，拿到positive实验结果的可能性较小。我想请问如果在细
胞内，有什么生物化学（或者遗传）的方法可以来检测核糖体与具体mRNA的binding活
性？ |
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s****6
发帖数: 34 | 30 Hello, Friends,
When I suspect one specific mRNA is a target of one microRNA, and I didn't
get a clue from those popular web-based target prediction tools. Can I
manually compare this microRNA with the 5'UTR and 3 UTR of that mRNA for
seed matching? What software could be used for this purpose?
Thanks a lot for any pointers! |
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X***n
发帖数: 366 | 31 Seed sequence is only about 6-nt, it's possible for it presents in mRNA
sequence by chance. Besides, seed sequence matching is not sufficient to
make a mRNA the target. You may try RNA22. You can loose the stringent by
allowing UN wooble and lower folding energy parameters. |
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E****A
发帖数: 184 | 32 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG，并且有完整的ORF，只是ORF1比
ORF2多出几十个氨基酸，剩余的氨基酸序列完全相同。请问，这条mRNA在细胞里被翻译
时会从哪个AUG上开始翻译？会同时被翻译成两条多肽链吗？
看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢？
多谢讨论！ |
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Z**********g
发帖数: 222 | 33 既然有alternative first exon,那就是可能有两条mRNA存在了.先RT-PCR一下,确定是
哪条mRNA(first exon or alternative first exon),如果只存在alternative first
exon的transcript,哪还有什么问题吗?如果只存在first exon的transcript,那就的检
测蛋白水平了,看哪个AUG起始翻译的.
alternative |
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Z**********g
发帖数: 222 | 34 1. first exon和alternative first exon是两条独立的mRNA（非alternate splicing
，而是由不同的promoter产生的transcript）,彼此的ORF应该不会影响吧.你的point应
该就是你刚开始说的,在first exon的mRNA上的前后两AUG会不会彼此影响。
2. 你怎么知道first exon AUG是uORF？uORF的确定是居于功能实验的（如果你确定了
细胞中该蛋白是由第二个AUG起始的翻译产物，你才可以称first exon AUG是uORF）。
事实上，我们知道AUG编码methionine，一个蛋白中前前后后methionine多的是，绝大
部分不能起始翻译嘛！ |
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E****A
发帖数: 184 | 35 多谢你的讨论！
1.我明白first exon和alternative first exon是由不同promoter产生的两条独立mRNA
，不过也
想知道彼此的orf会不会有影响。
2.我确实不确定first exon aug是uorf，不过只是第二个aug起始的orf是最早被克隆出
来当做
coding sequence的(跟human中的一样)，后来通过找est才发现的first exon和
alternative
first exon。mrna里确实有很多aug，不过只有这两个aug能被翻译啊。。
期待更多讨论和见解。
splicing |
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F*****e
发帖数: 182 | 36 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 37 提RNA的kit不贵，你完全可以全部都提，
等genotype结果出来吧不要的扔掉。
准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA
seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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m***o
发帖数: 272 | 38 在做5-race，目的是得到一个蛋白的short form。已经得到了一个从exon6开始转录的
短的RNA，而且也得到一些UTR序列在5intorn。 用的是ambion First choice RLM RACE
KIT. 得到的片段测序，mRNA起始的位点总是不一样。起始点最长有60bp的差别。而且
在UTR序列里面有3个ATG都在读码框架里，请问怎么知道哪个ATG是真正的翻译起始点？
除了RACE，还有什么实验可以确定mRNA的起始点呢？
另外一个问题，在做另一个蛋白的RACE时候，得到过两次先表达Exon5,然后是exon2的
序列，有这样的exon rearrangement 吗？就是先转录下游的exon然后再回过头转录上
游的exon? 第一次得到这个结果的时候觉得可能是artificial，但是用不同的primer又
得到了一次这样的结果。而且还是complete的exon序列。请各位发表点意见建议吧，我
google也没有找到类似的事情。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 39 嘿嘿，还是你明白
这个问题其实是molecular biology比较经典的问题。过去有很多解决方法。但是现在
。。。其实很简单。后面的ATG几乎没有start的机会。除非，搞个牛的基因，full
genomic sequence不清楚，那还需要primer extension一下，否则绝大多数都不需要这
么麻烦。他的race一般过去也是拿到一段sequence，然后重新设计primer在5 prime再
次做race。一般大小的mRNA有个几次就是full sequence了。
如果lz的mRNA有60bp的差别，最简单就是用这60bp做个RT-PCR，或者设计个probe在这
60bp的头上，做个northern就知道哪里开始了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 40 LZ现在的困惑不是转录起始位点，转录起始位点就是mRNA 5'UTR开始的位置，这个5'
RACE如果做的好的话直接就出来了，毕竟他genomic/cDNA序列基本是明确的，从前RACE
都是根据部分已知的序列来获取剩下的未知序列的，难度差多了。
LZ现在困惑的是翻译起始位点，这个和mRNA 5'端是否有60bp的差别关系不大，通过
northern也无法确定核糖体究竟从哪个ATG开始翻译。如果有ortholog就序列比对一下
看看其他物种中有没有已经鉴定过的同源蛋白，因为相对而言N端是保守的（不讨论
isoforms）。
就像你说的，基本上第一个ATG就是起始ATG，即使不是最佳的Kozak序列，至少也能低
水平的起始翻译，后面的ATG除非有IRES，否则很难有很强的表达，这甚至还有可能是
表达调控的一种方式。 |
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m***o
发帖数: 272 | 41 Philipli,十分感谢你的建议。
做short form 的目的是：wild type 和short form是在不同的组织中表达。以前认为
这个gene only expressed in one specific tissue A, but after the lab got the
knock out mice, it has different phenotype. We trying to figure out the
mechanism if these related with the specific tissue A or the gene also
expressed in other tissue but at short form.
我现在是打算把这个short form最长的ORF表达出来看看，但是老板感兴趣的那个组织
我没有检测到，所以还会继续race.
还有问题没有彻底明白：
1 现在这个short form的TSS,我测到的是大概90bp的差别，是不是可以说是一个TSS
cluster?
2 你说每个cluster里面有大概200bp的差别，记得看过... 阅读全帖 |
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c****e
发帖数: 188 | 42 I have two sets of microarray data, mRNA and microRNA, in the same samples.
I need a bioinformatic tool to help me find the connection between the
significantly differentially expressed microRNA and mRNA, and identify the
pathway involved in this interaction. Anybody has good suggestions? Thanks!! |
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l*****g
发帖数: 43 | 43 以前用invitrogen的lipofectamine RNAiMAX转EFP的mRNA，效果不错，但是经常也有第
二天看不见GFP的情况（半衰期短的EGFP）。最近用同一管RNAiMAX，转的效果奇差，只
看得见一点的荧光。不知道是不是RNAiMAX变坏了还是咋的。不到一年，没有过期。
mRNA跑胶，浓度都挺好。opti-medium换了，但是除了Glutamine换成glutamax没有大差
别。请问有什么建议，除了RNAimax，其它有甚么好的推荐？ |
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l*****g
发帖数: 43 | 44 用EGFP的mRNA转细胞，用RNAiMAX （in vitrogen），同一孔细胞，第一次可以达到100
%的delivery （EGFP信号），重复转移（同样的条件）第二次，三次转移效果就很差，
百思不得其解。请问有转mRNA有什么trick吗
以前也碰到这个问题，某几天90%是绿色的，某两天又很差，一直解决不了这个问题,很
困惑也很耽搁事情 |
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a****l
发帖数: 125 | 45 各位，本人加了drug treatment 后看到mRNA 的表达有变化（QPCR)，但做western 后
蛋白没太大变化，怎么办？mRNA 的变化有2－3 倍。是不是不好在蛋白水平看到变化？
谢先。 |
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d******r
发帖数: 124 | 46 一般来说，RNAi是降解整个mRNA，还是其中拥有同源序列的那部分mRNA？其他部分仍然
能转译表达？我用两个shRNA降解同一个基因，但是得到的表型却完全相反。有没有可
能是因为这两个shRNA降解了不同的exon，形成了不同功能的片段？ |
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d******r
发帖数: 124 | 47 一般来说，RNAi是降解整个mRNA，还是其中拥有同源序列的那部分mRNA？其他部分仍然
能转译表达？我用两个shRNA降解同一个基因，但是得到的表型却完全相反。有没有可
能是因为这两个shRNA降解了不同的exon，形成了不同功能的片段？ |
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e**o
发帖数: 345 | 48 文献说核糖体是40S和60S结合后被转运出核的。
蛋白翻译的文献说 40S先结合met-tRNA, eIFs 形成43S，然后到mRNA 形成48S。 最后
60S上去开始翻译。问题是这一步是发生在核内还是核外。是核糖体出核后40S，60S又
分离了。还是80S跟mRNA一起转运出核的？
最基本的概念都没搞清楚，看他们paper都发了。 上次lab meeting上有人提出这个问
题，竟然没人知道准确的大案。 |
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m****n
发帖数: 1066 | 49 Is there a way to differentiate the wild type Kras mRNA and mutatant type
Kras mRNA?
Thanks. |
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v***a
发帖数: 1242 | 50 做的是蛋白的overexpression，用抗体都看不到overexpression后蛋白level有变化，
但用普通的PCR和real-time PCR检测，却都有非常高的mRNA增量。特别是real-time
PCR，分析后竟然mRNA level在overexpression后增加了快1000倍。有这个可能吗？ |
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