E****A
发帖数: 184 | 1 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG，并且有完整的ORF，只是ORF1比
ORF2多出几十个氨基酸，剩余的氨基酸序列完全相同。请问，这条mRNA在细胞里被翻译
时会从哪个AUG上开始翻译？会同时被翻译成两条多肽链吗？
看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢？
多谢讨论！ |
W****C
发帖数: 1937 | |
E****A
发帖数: 184 | 3 我不是要检测RNA有没有表达啊，是想知道有没有两条蛋白表达。如果有表达的话，为
什么需要表达两条蛋白？怎么分析多出来的那几十个氨基酸的作用呢？
【在 W****C 的大作中提到】
: 当然有可能， RTPCR测一下不就确认啦？
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n***w
发帖数: 2405 | 4 where does the polymerase bind? If it binds in the promoter region in front
of the first ORF, then it should translate the full-length protein. Don't
worry about the second one.
You may need to look up "internal ribosome entry site (IRES)" to answer your
second question.
Above is my opinion. |
j****x
发帖数: 1704 | 5 和原核mRNA不一样，真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则，所以同一条mRNA翻译
出不同的产物很常见（即使不存在IRES的情况下），尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
首先检查一下，你这2个AUG，是否都符合Kozak consensus规则，简言之如果-3位为A且
/或+4位为G的话，那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大，这样的AUG如果在5'UTR 区
域中存在甚至还不止一个的话，那么自然对正常的ORF翻译有竞争性（核糖体）的副作
用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。
【在 E****A 的大作中提到】
: 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG，并且有完整的ORF，只是ORF1比
: ORF2多出几十个氨基酸，剩余的氨基酸序列完全相同。请问，这条mRNA在细胞里被翻译
: 时会从哪个AUG上开始翻译？会同时被翻译成两条多肽链吗？
: 看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢？
: 多谢讨论！
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W****C
发帖数: 1937 | 6 没有rna， 就不会有蛋白啊，
要直接测比较麻烦。如果有识别C端的单抗的话WB也可以看到两条带啊, 或者你把整个
promoter+gene克隆， C端再加tag， 看看有没有两条带啊。 这种variant很多， 可能
会有稳定性/分部/功能的差别。
【在 E****A 的大作中提到】
: 我不是要检测RNA有没有表达啊，是想知道有没有两条蛋白表达。如果有表达的话，为
: 什么需要表达两条蛋白？怎么分析多出来的那几十个氨基酸的作用呢？
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V********n
发帖数: 305 | 7 个人建议：
１）搞个蛋白电泳看是否有两种肽，没有抗体就加Tag。先搞清楚是否有问题存在。
２）如果确实有两种肽，分析未表达的序列里面的氨基酸组成。重点是磷酸化位点，疏
水氨基酸等，找线索分析功能差异。
３）造成上游AUG不能１００％利用的原因很多。比如不在最佳Kozak consensus里，
IRES，上游AUG所在位置有特殊高级结构等等。
总之，先要确定问题是否存在。 |
C*****h
发帖数: 926 | 8 如果是真核生物，应该从第一个AUG翻译，第二个AUG基本上不会翻译。
【在 E****A 的大作中提到】
: 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG，并且有完整的ORF，只是ORF1比
: ORF2多出几十个氨基酸，剩余的氨基酸序列完全相同。请问，这条mRNA在细胞里被翻译
: 时会从哪个AUG上开始翻译？会同时被翻译成两条多肽链吗？
: 看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢？
: 多谢讨论！
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b****r
发帖数: 17995 | 9 second this
遍。
【在 j****x 的大作中提到】
: 和原核mRNA不一样，真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则，所以同一条mRNA翻译
: 出不同的产物很常见（即使不存在IRES的情况下），尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
: 首先检查一下，你这2个AUG，是否都符合Kozak consensus规则，简言之如果-3位为A且
: /或+4位为G的话，那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大，这样的AUG如果在5'UTR 区
: 域中存在甚至还不止一个的话，那么自然对正常的ORF翻译有竞争性（核糖体）的副作
: 用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。
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E****A
发帖数: 184 | 10 thx for yr opinion. but why do u think that translation doesn't start from
the AUG in the sencond exon? is there any proof?
front
your
【在 n***w 的大作中提到】
: where does the polymerase bind? If it binds in the promoter region in front
: of the first ORF, then it should translate the full-length protein. Don't
: worry about the second one.
: You may need to look up "internal ribosome entry site (IRES)" to answer your
: second question.
: Above is my opinion.
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E****A
发帖数: 184 | 11 多谢你的见解。
刚才在wiki里看到你说的Kozak consensus是(gcc)gccRccAUGG，R可以是A也可以是G。
查了下两个AUG都符合。你说对正常的ORF有竞争性是指下游的ORF不会被翻译还是翻译
会变弱？
其实我刚开始的帖子里没有完全说出来，在1st exon和2nd exon中间有个alternative
first exon。这个alternative first exon所属的mRNA只有在2nd exon上有AUG，这个
2nd exon和上面那条mRNA的2nd exon是一样的。这么说，1st exon上的AUG会对这条
alternative 1st exon所属的mRNA的翻译产生抑制作用？有文章说明这种抑制作用的强
弱吗？
多谢。
遍。
【在 j****x 的大作中提到】
: 和原核mRNA不一样，真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则，所以同一条mRNA翻译
: 出不同的产物很常见（即使不存在IRES的情况下），尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
: 首先检查一下，你这2个AUG，是否都符合Kozak consensus规则，简言之如果-3位为A且
: /或+4位为G的话，那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大，这样的AUG如果在5'UTR 区
: 域中存在甚至还不止一个的话，那么自然对正常的ORF翻译有竞争性（核糖体）的副作
: 用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。
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E****A
发帖数: 184 | 12 嗯，明白，多谢！
【在 W****C 的大作中提到】
: 没有rna， 就不会有蛋白啊，
: 要直接测比较麻烦。如果有识别C端的单抗的话WB也可以看到两条带啊, 或者你把整个
: promoter+gene克隆， C端再加tag， 看看有没有两条带啊。 这种variant很多， 可能
: 会有稳定性/分部/功能的差别。
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E****A
发帖数: 184 | 13 多谢指导！
那怎么分析磷酸化位点，疏水氨基酸等功能差异呢？
【在 V********n 的大作中提到】
: 个人建议：
: １）搞个蛋白电泳看是否有两种肽，没有抗体就加Tag。先搞清楚是否有问题存在。
: ２）如果确实有两种肽，分析未表达的序列里面的氨基酸组成。重点是磷酸化位点，疏
: 水氨基酸等，找线索分析功能差异。
: ３）造成上游AUG不能１００％利用的原因很多。比如不在最佳Kozak consensus里，
: IRES，上游AUG所在位置有特殊高级结构等等。
: 总之，先要确定问题是否存在。
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w*******d
发帖数: 396 | |
E****A
发帖数: 184 | 15 嗯，多谢讨论
【在 w*******d 的大作中提到】
: 分别把这两个AUG突变了看看。
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f*******7
发帖数: 1019 | |
Z**********g
发帖数: 222 | 17 既然有alternative first exon,那就是可能有两条mRNA存在了.先RT-PCR一下,确定是
哪条mRNA(first exon or alternative first exon),如果只存在alternative first
exon的transcript,哪还有什么问题吗?如果只存在first exon的transcript,那就的检
测蛋白水平了,看哪个AUG起始翻译的.
alternative
【在 E****A 的大作中提到】
: 多谢你的见解。
: 刚才在wiki里看到你说的Kozak consensus是(gcc)gccRccAUGG，R可以是A也可以是G。
: 查了下两个AUG都符合。你说对正常的ORF有竞争性是指下游的ORF不会被翻译还是翻译
: 会变弱？
: 其实我刚开始的帖子里没有完全说出来，在1st exon和2nd exon中间有个alternative
: first exon。这个alternative first exon所属的mRNA只有在2nd exon上有AUG，这个
: 2nd exon和上面那条mRNA的2nd exon是一样的。这么说，1st exon上的AUG会对这条
: alternative 1st exon所属的mRNA的翻译产生抑制作用？有文章说明这种抑制作用的强
: 弱吗？
: 多谢。
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E****A
发帖数: 184 | |
E****A
发帖数: 184 | 19 多谢！
RT-PCR和Northern blot验证了两条mRNA的存在。
看了楼上的PNAS文章，说uORFs correlate with significantly
reduced protein expression of the downstream ORF.
不知first exon的uORF会不会对alternative first exon的ORF产生啥影响或抑制作用
呢？
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 既然有alternative first exon,那就是可能有两条mRNA存在了.先RT-PCR一下,确定是
: 哪条mRNA(first exon or alternative first exon),如果只存在alternative first
: exon的transcript,哪还有什么问题吗?如果只存在first exon的transcript,那就的检
: 测蛋白水平了,看哪个AUG起始翻译的.
:
: alternative
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Z**********g
发帖数: 222 | 20 1. first exon和alternative first exon是两条独立的mRNA（非alternate splicing
，而是由不同的promoter产生的transcript）,彼此的ORF应该不会影响吧.你的point应
该就是你刚开始说的,在first exon的mRNA上的前后两AUG会不会彼此影响。
2. 你怎么知道first exon AUG是uORF？uORF的确定是居于功能实验的（如果你确定了
细胞中该蛋白是由第二个AUG起始的翻译产物，你才可以称first exon AUG是uORF）。
事实上，我们知道AUG编码methionine，一个蛋白中前前后后methionine多的是，绝大
部分不能起始翻译嘛！
【在 E****A 的大作中提到】
: 多谢！
: RT-PCR和Northern blot验证了两条mRNA的存在。
: 看了楼上的PNAS文章，说uORFs correlate with significantly
: reduced protein expression of the downstream ORF.
: 不知first exon的uORF会不会对alternative first exon的ORF产生啥影响或抑制作用
: 呢？
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E****A
发帖数: 184 | 21 多谢你的讨论！
1.我明白first exon和alternative first exon是由不同promoter产生的两条独立mRNA
，不过也
想知道彼此的orf会不会有影响。
2.我确实不确定first exon aug是uorf，不过只是第二个aug起始的orf是最早被克隆出
来当做
coding sequence的(跟human中的一样)，后来通过找est才发现的first exon和
alternative
first exon。mrna里确实有很多aug，不过只有这两个aug能被翻译啊。。
期待更多讨论和见解。
splicing
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 1. first exon和alternative first exon是两条独立的mRNA（非alternate splicing
: ，而是由不同的promoter产生的transcript）,彼此的ORF应该不会影响吧.你的point应
: 该就是你刚开始说的,在first exon的mRNA上的前后两AUG会不会彼此影响。
: 2. 你怎么知道first exon AUG是uORF？uORF的确定是居于功能实验的（如果你确定了
: 细胞中该蛋白是由第二个AUG起始的翻译产物，你才可以称first exon AUG是uORF）。
: 事实上，我们知道AUG编码methionine，一个蛋白中前前后后methionine多的是，绝大
: 部分不能起始翻译嘛！
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