m******m
发帖数: 535 | 1 刚刚接触细胞生物学，没做过knockdown，这里问两个关于mammalian细胞knockdown的
初级问题，请大家不要笑话。
1） 准备在raw cell line 中 knockdown一个kinase，初步看看对下游cytokine的表达
有没有影响，看文献有人用Dharmacon的siRNA pool转化，有人用lentivirus shRNA，
请问哪种方法更简单？
2） 如果直接转化siRNA，等3－4天以后，细胞都分裂了好几代了，是不是每隔细胞内
的siRNA的量减少很多，这样是不是knockdown的效果就不好了？
3） 为什么siRNA可以直接转化knockdown基因表达，但是好像很少人直接转化shRNA去
knockdown的？为什么shRNA都要科隆在plasmid载体或者virus载体内呢？直接转化难道
不能被dicer酶加工变成siRNA吗？（因为从文献上查到了一个shRNA的序列，如果能直
接合成然后象siRNA那样转化，岂不是能剩了买siRNA的钱，又剩去了科隆shRNA到载体
的时间）。
比较初级的问题，请别笑话！
谢谢！ |
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g****y
发帖数: 101 | 2 大家好,
我有一个课题是通过抑制一个oncogene的功能来治疗这个基因突变（Gain of function
）引起的癌症（T cell leukemia），之前通过molecular docking从NCI 筛选小分子化
合物来抑制蛋白与蛋白的相互作用，做的不是很理想。
最近想通过SiRNA或者ShRNA抑制这个基因的表达，最终目的是为了能在体内有效的特异
地抑制肿瘤细胞里这个oncogene的表达，从而可以选择性的杀死肿瘤细胞。对这个领域
不是很熟悉，读了一些文献之后上来寻求大家的帮助，
预见的可能问题及解决方法：
1：SiRNA 或者ShRNA的特异性：
SiRNA 或者ShRNA可能会非特异的抑制其它基因的表达，可以通过仔细选择SiRNA 或者
ShRNA的序列(避免同源序列)来降低非特异抑制，请问大家还有什么办法来提高特异性
吗？
2：体外合成的SiRNA在体内容易被降解：
通过对SiRNA进行一定的修饰可以提高稳定性，但是我觉得通过病毒介导表达ShRNA 可
能是一个更好的办法，因为这个是由基因突变（Gain of function）产生的疾病，体外
合成的SiRNA不能... 阅读全帖 |
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d******o
发帖数: 37 | 3 请教版上的大侠，设计了3条siRNA， KD效率分别为 siRNA#1～70%， siRNA#2～60% 和
siRNA#50%。
请问：
1.）这种情况下，为了进一步提高KD效率， 有没有必要把三个pool到一起？（pool不
是就不好排除off-target或其他non-specific effects了么？）
2.）pool后转染的终浓度跟单个siRNA的终浓度一样么？
3.）如果转染终浓度跟单个siRNA的终浓度一样的话，pool到一起会提高KD效率么，还
是SiRNA#1的70%的效率被稀释了？
本人菜鸟，盼班上的牛牛解惑！
不甚感激！ |
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m*****n
发帖数: 760 | 4 本人对siRNA的设计和应用几乎无知，问题比较菜，请大家不要见笑。
需要用siRNA来knockdown一个外源表达的fusion protein(GFP-GOI)，
因为不想影响endogenous GOI，所以想请教能不能设计siRNA只针对GFP，而不是GOI？
这样的siRNA会有效果吗？
另外大家都用什么program来设计siRNA，另外在哪家公司买siRNA啊？
谢谢了。 |
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v***2
发帖数: 131 | 5 siRNA knock down 头痛问题
在下正在用siRNA knock down几个基因，使用的是电穿法（脂质法效果不好），所用
siRNA都是公司里已经validated的但有2个target gene却出现问题，A基因敲除后，
mRNA和蛋白都效果很好，但是control siRNA 却使靶基因表达量增高很多，这是怎么回
事啊？
B基因更离谱，siRNA 反而使靶基因增高表达3-4倍，这是脱靶效应吗？是siRNA 浓度太
高了吗？
先谢谢各位了 |
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S******e
发帖数: 393 | 6 买了几个基因的siRNA pool(含3个siRNA)，同样的浓度与方法去转，有的work, 有的不
work, 用的是invitrogen 的 lipofectamine RNAiMAX
不甘心，又根据发表的paper(nature子刊)上的序列，将KD没效果的基因的siRNA序列重
新从dharmacon合成Duplex, 但转染后在我手里还是不work, 但发表的paper里用的也是
siRNA,且KD效果很好阿，所以序列应该是work的。是不是我方法有问题？
有什么好地siRNA 转染方法？ lentivirus介导的shRNA转染会不会KD成功率更高些？
多谢！
shRNA construct(不用virus，就是一般的质粒)的KD效果会不会比siRNA效果好？ 有人
比较过么？ |
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C*********h
发帖数: 83 | 7 有微友私信问设计siRNA、shRNA和gRNA. 今天先说siRNA和shRNA吧。
一般我是take advantage of sigma. 他们有现成的shRNA产品，而且反响很好。
当然了，土豪可以自己去Dharmacon订购siRNA， 或者在sigma订购shRNA,甚至是包装好
的病毒。
1.第一步去sigma英文网站，一定要是英文网站
http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html
#华夏小奇说实验的事#设计siRNA和shRNA
2. 搜索你感兴趣的基因。如TNFR, 出来结果之后点击shRNA(下图黑色剪头所示)
插播广告 订购基因敲除小鼠请访问公司网站（2-4个月，小鼠转基因、敲除敲入、条件
性敲除）
#华夏小奇说实验的事#设计siRNA和shRNA
3. 点击进入下个页面，点击pricing，会出现每个shRNA的hairpin的序列。
如下面的序列，介于“CCGG”和"CTCGAG"之间的，就是shRNA的目标序列。
可以根据这个序列设计siRNA和shRNA(自己合成hairpin, 退火连入pLKO or Te... 阅读全帖 |
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z****i
发帖数: 35 | 8 最近要筛选几个分子，请公司设计了siRNA，他们每个分子给设计三种siRNA，说保证至
少有一种有效，但是鉴定干扰效率发现有些最多只能达到40%，指导我的博后建议说要
不试一下选用两个siRNA，1:1混合转染，说这种cocktail式转染,效率会比较好，我知
道有些公司给设计的siRNA就是一个pool，效率比较好，可是我们这种自己制造的混合
物和人家公司的能一样吗？
哦，我们用的是polyplus的Interferin，一直都还挺好用，转染时siRNA的浓度是20nM
，应该问题不大，阳性对照的干扰效率是70%多。
对于提高腹腔巨噬的干扰效率，有经验的前辈们能不能说说你们的方法？
谢谢大家... |
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g****y
发帖数: 101 | 9 谢谢，我当然有兴趣了，能不能告诉我siRNA efficacy predition是怎么做的吗？ 通
过Blast? 我看有一些文献为了筛选specific的SiRNA, 设计好几个不同的SiRNA去处理
细胞, 然后做Microarray去看这些SiRNA的调控的基因，通过对比来看特异性，不过我
觉得这个好像也不是很可靠，毕竟Microarray里表达量下降的基因很多，我们也不知道
哪些基因是直接由SiRNA抑制的
100% |
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n****y
发帖数: 819 | 10 请问 siRNA transfection, 我用的是dharmacon的transfection reagent, 6 well
plate, 每一孔我用了4 ul, 好像再多的话细胞很快就死了， 然后siRNA 从10 nM 到
100 nM 都式过。 我的问题是， transfection reagent 和 siRNA之间是不是应该有一
个固定的比例呢？ 比如 10 nM siRNA用 4 uL transfection reagent, 20 nM 用 8 uL
? 多谢！ |
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S*********u
发帖数: 980 | 11 我用了cell signaling 的akt siRNA I, knockdown human cancer cell的akt protein
. 用了50~100nM的浓度，mRNA 降低了80%， 但是protein只降低了50%左右（pan-Akt）
。造成的结果是，虽然pan-akt有降低，但是 p-Akt的信号降低很少，而且细胞在
knockdown之后，我关心的表型的变化也有限。
是不是因为这个siRNA只能target akt的其中一种isoform？ 不知道有没有同学用过效
果更好的siRNA, 或者是siRNA cocktail, 如果有的话，能不能推荐一下？
万分感谢！ |
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a*******u
发帖数: 19 | 12 看文章的时候发现，有的文章只用了一个siRNA，而有的用了2-3个siRNA，还要求siRNA
-resistant的plasmid。
问题是，什么样的情况下，只用1个siRNA就可以了？ |
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w********r
发帖数: 1431 | 13 双链。直接订RNA oligos可能不成，据说siRNA上面还会加有一些修饰，
siRNA末端不同的公司也会加两个dT还是dA什么的，可以参考各家公司订货的说明。
siRNA是否管用和长度没啥太大的关系，我们一般去Whitehead设计siRNA的网站上设计
三个，总有可以用的 |
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A***g
发帖数: 191 | 14 实验室要合成很多条siRNA，我建议最好每条siRNA都做HPLC纯化，但是合成这个siRNA
好贵啊，每条加上HPLC要260刀。
今天听说不用HPLC纯化也是可以的，版上有没有人做过呢，哪个公司合成RNA会便宜点
啊？ |
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V*f
发帖数: 171 | 15 siRNA transfection only gives transient knockdown (3-7 days). If the
phenotype takes longer than 3-7 days to show, then siRNA hardly works.
Also some cell types are not easy to transfect.
Dharmacon and Ambion are good companies for siRNAs. |
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b******e
发帖数: 3348 | 16 问题可能有些弱智，老板要求转染某个基因的siRNA到一个动物细胞，以前我没做过
siRNA transfection,只用lipofectamine 2000转染过某基因的overexpress vector到
动物细胞，网上查了一下，dharmacon有这个基因的siRNA,是不是买了那个smartpool,
然后用lipofectamine 2000就可以转染了（当然成功与否，到不到50%得实验做了才知
道）,那个smartpool是四个RNAs的pool对吧，不知道这个过程是不是正确的。
菜鸟一个，敬请指教，非常感谢。如果有protocl能够让小弟看看那就更好了
包子答谢。
PS，不需要长期stock,所以暂时不考虑shRNA. |
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h*****G
发帖数: 113 | 17 小弟刚开始做stem cell，现在需要用siRNA 转进mouse stem cell 去knockdown基因。
试了roche的x-treme siRNA transfection kit， 效果不理想，几乎没有knock down
target 基因。
希望有经验的大侠推荐合适的试剂，使用的siRNA的量和注意事项。
thanks～～ |
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h******y
发帖数: 1374 | 18 请问有用过OriGene的Trilencer-27 Human siRNA的同学吗？请问效果咋样啊？
3个unique 27mer siRNA duplexes 再加一个siRNA control是$390，好像比别的公司的便宜不少。 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 19 你这个直接合成然后转染是什么意思吧.
是直接合成shRNA(非DNA)?这会比siRNA便宜吗,会比siRNA效率高吗,能延长时效吗?都不
能吧.
是直接合成shRNA的DNA?它能被转录吗,有干扰效率吗,能延长时效吗?都不能吧.
siRNA |
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t*d
发帖数: 1290 | 20 off-target effect 是关键问题。如你所说，所有癌症治疗手段都有副作用。问题是副
作用是不是在可承受范围内。每个现在市面上的药都花了大钱从无数先导物里面筛出来
的。如果你能塞出一个副作用在可受范围内的 siRNA，就发财了。
看上去 siRNA 比化学小分子更容易被 rationally des
igned。可是目前 siRNA 这个
领域还没有这样成功的例子。也许只是时间问题？ |
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g****y
发帖数: 101 | 21 To Ttd:
肝癌通过这种方法治疗应该会更好,当然也会面临特异性的问题,
我也觉得SiRNA比小分子化合物更靠铺, 今年AACR的时候和一个药厂的前辈聊天的时候
说到我在筛选小分子化合物来抑制蛋白蛋白之间的相互作用, 前辈直接说这种project
灌水可行, 都是做药物研发不可靠. 我也觉得是这样的,毕竟蛋白质作用的surface比较
大, 小分子药物的特异性不够高.
至于SiRNA的副作用在能不能在可受范围内,这个无法预测, 只有在优化SiRNA的设计并
且提高T细胞的感染效率后去试了才知道. |
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E**********1
发帖数: 73 | 22 Hi all:
Recently I planning to do siRNA, but I have a detailed question.
I got siRNA from Dharmacon, and it came as dried pellet, which means I need
to dissolve it in some solutions. The instruction suggests resuspending the
dried pellet in RNase-free 1X siRNA buffer (60mM KCl, 6mM HEPES-KOH, pH7.5,
0.2mM MgCl2), or in RNase-free water for short-term storage.
It will take time to place another order only for those buffers. So I am
wondering how you guys do that. Can we make the buffer by ourselv... 阅读全帖 |
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v***2
发帖数: 131 | 23 谢谢楼上朋友，我现在用200nM siRNA (final concentration)，因为以前我用脂质法
转染时候，用低浓度效果很差，大概只有20-30%的KD,但control没问题，所以我这次直
接就用高浓度siRNA了，看来用电转法，siRNA浓度必须要降下来？ |
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n**8
发帖数: 221 | 24 请问版上的大侠一般用哪个公司的siRNA？
本人菜鸟，对各家公司的siRNA效果行情不了解，
比较了一下价格，好像sigma 的 predesigned的siRNA相对便宜 10nmol, $140.
请问有用过的大侠么？ knockdown efficiency 高不高?
不甚感激！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 25 Off-target 中奖拉 搂住的那单locus siRNA
还是考古下上个月的 旧贴 如何
同主题阅读：现在发文章还需要2套siRNA吗？
[版面:生物学][首篇作者：CAMS] , 2012年06月19日
answer:
一般至少要3 different oligos才能自己放心
siRNA的off target是非常严重的
最严谨的是shRNA KD,然后rescue with ectopic expression
shRNA也需要2-3个independent clone to exclude clonal effect
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31683985.html
knockdown |
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a****k
发帖数: 1130 | 26 哦，R2D2是fly里面的name
你没说具体要做什么，human system有个比较tricky的事情是human Ago2结合single-
strand RNA的能力很强，siRNA如果有一点single strand在里面，只用Ago2 itself就
可以看到activity。如果你用stringent的duplex siRNA，除了human Ago2，还需要
C3PO (Tanslin & Trax)。human system不需要Dicer-TRBP for siRNA loading
建议你可以看下这篇文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552258 |
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X***n
发帖数: 366 | 27 siRNA is fully reverse complement to targeting site, so it induces target
mRNA degradation. miRNA is partially reverse complement to targeting site,
it inhibit mRNA translation. In addition, the biogenesis of siRNA and miRNA
is somewhat different. |
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c*********t
发帖数: 340 | 28 ffff6699 is right
I just had an exam on this question:)
siRNA is exogeneous,about 21nt, usually completely complementary
miRNA is endogeneous, about 70nt, processed to give smaller, mature miRNA of
approximately the same size of that of siRNA; usually not 100%
complementary. Could result in mRNA degradation, inhibition of translation,
etc.. For translation inhibition it binds to 3'UTR most of the times but
some miRNA binds to 5'UTR or intronic regions too
This was what i wrote down and got full |
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p******d
发帖数: 3737 | 29 有人用过鼠的Notch4 siRNA吗，有没有什么经验，已知work的sequence或者哪个公司的
产品好用
的？试过ambion presigned的 notch1 的siRNA，完全不管用。 |
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w***a
发帖数: 4361 | 30 或者同时设计多个siRNA target同一基因，然后看你感兴趣的phenotype是否sequence
specific。
对于siRNA off target effect，大部分打酱油的paper都直接无视。俺建议你也别费事
算鸟。 |
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m*********7
发帖数: 5207 | 31 能不能设计siRNA只针对GFP，而不是GOI？
这样的siRNA会有效果吗？ |
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H****H
发帖数: 11039 | 32 外源表达的干嘛需要knockdown啊？
你不转到细胞里不就行了么？
要用siRNA knockdown GFP-GOI而不影响GOI表达当然可以做到，设计target GFP序列的
siRNA就可以了。 |
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j********r
发帖数: 156 | 33 Thanks. So if I get very quick phenotypes in cultured cells using siRNA
transfection, will the data be convincing? Do I still need stable shRNA (
regular of conditionally if it is lethal) to confirm the results?
It seems there are also disadvantages of shRNA, such as in some cases
sequence-specific toxicity (probably due to overloading the RNAi machineary)
. But I am not sure about the down side of using siRNA. |
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k****o
发帖数: 589 | 34 最近用他家的stealth siRNA转染一种难搞的原代细胞，尚未成功。现在在尝试不同的
transfection方法，不过心里始终有个疑问：他家的stealth系列有必要用不同序列
siRNA的混合物
吗？
谢谢解答 |
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b**********8
发帖数: 349 | 35 如题，请问大家用siRNA沉默靶基因的时候，沉默效率一般是多少？我一直用的
Dharmacon公司的siRNA,最初买回来的时候按照他们公司的mannual的建议量和protocol
，通过realtime RT-PCR验证至少都有90%的沉默效率，几乎百分之百。可是后来突然开
始，只有大约70~80%的沉默效率了，以为是stock降解，于是买了新的回来，还是只有
这样的效率，想请问大家70~80%的沉默效率正常吗？ |
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q*****n
发帖数: 1035 | 36 有效的shRNA的sense序列可以直接用来合成siRNA么？
很多有效的shRNA/siRNA序列并不是AA（AG）开始的，有影响么?
谢谢 |
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n******2
发帖数: 971 | 37 I have the exact same question as LZ asked. Why can't we just use shRNA to
do transient transfection to knock down a gene? Once the shRNA constructs
get into cells, small hairpin RNA will be transcripted, which will be
further chopped by Dicer into siRNA. Thereafter, shRNA shares the same
mechanism for knocking down certain gene as siRNA does. What's the reason
to make stable transgenic cell line? |
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C*****h
发帖数: 926 | 38 1. ShRNA needs time (24-48 hours) to get maximum expression, while siRNA
can function immediately after transfection.
2. For a lot of cell lines, transfection efficiency of shRNA-plasmids
(large size) is low, while that of siRNAs is high because of the small size.
to |
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m******m
发帖数: 535 | 39 谢谢！
不过如果文献上已经查到了好用的shRNA序列，为什么不能直接合成然后转染呢？siRNA
买个pool要好多美刀呢，可是缺很难查到有报道的好用的siRNA序列去合成转染。 |
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d*p
发帖数: 534 | 40 siRNA 还是一个不错的方向，毒性和specific delivery是药界的共同的问题，也是
siRNA目前最大障碍了，不过对肝脏疾病我觉得还是很有用的。 |
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k****o
发帖数: 589 | 41 本着科学的态度，应该至少用两个siRNA序列，要是你还能用antisense一类的更好
实际操作中，很多人是看投什么杂志的。JBC的话，有时候一个序列也过关，看
reviewer了
记得加control siRNA倒是真的 |
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D******9
发帖数: 2665 | 42 有没有人比较过同样的working SEQUENCE， siRNA还是shRNA的KD效率高？不塞选
stable cells. 转染siRNA或转导Lentivirus后2-3天比较。 |
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z******5
发帖数: 30 | 44 弱弱的问一下 从公司order的siRNA是双链还是单链？
是否可以从公司(如IDT)直接order RNA oligos 做siRNA用？
顺便问一下使用pLKO.1做knockdown时如果选择的shRNA序列少于21bp (如19bp)， 是否
work?有没有载体可以选择较短的shRNA？
多谢。 |
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B***e
发帖数: 46 | 45 最近screen了一些siRNA, 打算重复一下positive的results，发现Dharmacon 一个
siRNA还挺贵的，有哪家公司的性价比比较好吗？
多谢了。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 46 分别转，lipo2000转质粒的效率在我的手里效率比较差（也可能我们的细胞比较不容转
染）。
siRNA和lipoRNAiMax在一个管子里混好，
DNA和lipofectimine或者lipoLTX在另一个管子里混好，
然后一起加进去。
因为两种东西一起加毒性会大一点，细胞会死一些，
所以转染的时候，细胞的起始密度可以比单独转染siRNA或者质粒的密度要高一点 |
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C******T
发帖数: 300 | 47 最近需要Knockdown一个蛋白，然后把一个Mutant蛋白transfect进去看看能不能rescue
。哪位知道siRNA-resistant mutants要怎么得到？我查了一下文献，没有人提供这个
siRNA-resistant mutants要突变哪些位点？还是我买一个vector，把mutant的cDNA放
到这个vector上？
多谢多谢 |
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b****e
发帖数: 52 | 48 大家遇到过这种情况吗? 订了3个不同siRNA,RNAiMax 转染48h,western显示与negative
ctrl siRNA比,目标蛋白反而增加了.是offtarget effect吗?还是转染试剂影响了gene
表达(因为没做nontransfected ctrl) |
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c******t
发帖数: 108 | 49 求助啊~siRNA转染组比对照组有更高的目的基因的表达 （大概高30-40%），且统计学
上P<0.01.
完全按照protocol来，应该没标错样品，转染了2天后，换成正常的培养液，再过2天，
收了细胞，提了RNA，做了PCR。怎么会这样？
有没有可能siRNA在转染4天后就失效了？转染组细胞为了弥补之前的“被抑制”，就更
多的表达目的基因？
谢谢大侠们！ |
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g*******r
发帖数: 129 | 50 一般选用公司己经validated siRNA机会会好些, 或者你要试上二到三个不同位点.
转染成功与否也应该考虑. 用针对house keeping gene mRNA 的control siRNA 做对照
. |
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