j*********o
发帖数: 237 | 1 最近在做一课题，在两种人的肿瘤细胞系中瞬转siRNA knock down了某个基因，结果第
二天就发现细胞大量死亡，到第三天细胞基本死光光，同时做的non-targeting siRNA
control细胞生长正常，初步确认是这个基因的下调导致了细胞死亡。
但问题是，细胞死的太快了，试了好几个浓度，要么太低了没有RNAi效果，高了细胞就
翘了，导致无法具体分析细胞死亡的原因和后面的分子机制。
想过tet-on诱导性RNAi，但目前公司卖的tet系统基本都是用cmv promoter,似乎不能指
导shRNA的转录，但是可以知道microRNA转录，不知能否设计针对该基因的microRNA来
做诱导性的knock down? 至于如何设计不太了解，
没方向了，想请教一下在这方面有经验的同志，任何建议都欢迎！！
多谢先！ |
O******e
发帖数: 4845 | 2 Off-target effects might have contributed to what you got. I would try
several
more siRNA oligos targeting different regions of your gene to confirm the
death phenotype. At the same time, try to rescue with resistant constructs.
siRNA
【在 j*********o 的大作中提到】
: 最近在做一课题，在两种人的肿瘤细胞系中瞬转siRNA knock down了某个基因，结果第
: 二天就发现细胞大量死亡，到第三天细胞基本死光光，同时做的non-targeting siRNA
: control细胞生长正常，初步确认是这个基因的下调导致了细胞死亡。
: 但问题是，细胞死的太快了，试了好几个浓度，要么太低了没有RNAi效果，高了细胞就
: 翘了，导致无法具体分析细胞死亡的原因和后面的分子机制。
: 想过tet-on诱导性RNAi，但目前公司卖的tet系统基本都是用cmv promoter,似乎不能指
: 导shRNA的转录，但是可以知道microRNA转录，不知能否设计针对该基因的microRNA来
: 做诱导性的knock down? 至于如何设计不太了解，
: 没方向了，想请教一下在这方面有经验的同志，任何建议都欢迎！！
: 多谢先！
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j*********o
发帖数: 237 | 3 谢谢，我的siRNA是在dharmcon买的，实际上是一个pool，一共有4条siRNA，商品化的
siRNA需要测试off-target effect吗？也许可以用小鼠的cDNA去rescue。这个基因在小
鼠和人中高度同源。 |
n****n
发帖数: 165 | 4 Rescue assay is really important for your phenotype. I guess your gene maybe
have some function in Mitosis. |
