A*****n
发帖数: 243 | 1 454贵，而且reads数目和总的碱基数一般来说没有Illumina多
但是对于de novo的基因组拼接尤其是metagenome效果还是
比Illumina强很多的。 |
|
h*********9
发帖数: 361 | 2 版上时不时就有人上来问克隆问题，我就简单说一下个人的一点点经验：
克隆的第一步一般都是从PCR开始的。PCR关键是引物设计。推荐用免费的primer3。手
动设计注意引物一般GC含量45%-55%。长度在20-24之间。3'端最好不要有很多GC在一起
（40%即可）,以减少非特异产物。内切酶位点一般加在引物的5'端，最好有4-6个以上
保护碱基以利酶切（很多酶对此有硬性要求，详情参见NEB目录）。设计好的引物可以
到www.idtdna.com察看二级结构等引物信息。
第二步酶切（当然也可用TA克隆法）很关键，一定要酶切彻底才会有较高的连接效率，
我的经验是对大多数质粒，一个微克用NEB的酶1微升（10-20 U）/3-4小时，50微升体
系。PCR产物酶量要适度增加因为长度短末端多。难切的酶可酌量延长时间或加大酶量(
难不难切可参见NEB每个酶后面的说明：After a XXX-fold overdigestion with XhoI,
> 95% of the DNA fragments can be ligated with T4 DNA Ligase (at a 5'
term |
|
z*****6
发帖数: 1486 | 3 甲醛，尿素，甲酰胺对DNA或ＲＮＡ的变性是不是可逆的？
我只知道原理是这些极性的东西会与核酸的碱基形成氢键，从而打开双键，破坏二级结
构。 不知道换掉溶液后会不会renature?
谢谢大家~~ |
|
q*****d
发帖数: 445 | 4 没有intron啊，我要构建一个cellulosome的骨架，这上面有一个AGA2基因的信号肽，
三个cohesion分别来自三个微生物，第二和第三个cohesion之间有一个CBD(cellulose
binding domain)，现在问题出在第二个cohesion序列上，如果用这人序列就不能翻译
为一个蛋白，但是把第二个改变一下大小，就可以翻译成一个蛋白了。到底是什么原因
，我现在也没有搞清楚，我反正是把序列改动一下，就OK了！难道这个Vector NTI能够
自动识别intron吗？ 这是最新的序列，大家如果有空可以比对一下，只有几个碱基不
同而已，太令人匪夷所思了。
atgcagttacttcgctgtttttcaatattttctgttattgcttcagttttagcacaggaactgacaactatatgcg
agcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccgtactctttgtcaacgactactattttggccaacgggaaggc
aatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtttgtcagtaattgcgg |
|
s***o
发帖数: 326 | 5 带着坚定的步伐和气势，华大基因踏入了基因组学这个传统上被认为是欧美国家的领
域，《生物技术》编辑惊呼：“狼来了！如果我们再不小心，华大将很快在各个方面超
过我们。”
大学尚未毕业的罗锐邦同学，科研事业发展有声有色，进入华大基因不满一年，已成为
生物信息部门的项目负责人之一。这位年仅21岁的小伙子现在领导着由几十位年纪相仿
的同事所组成的团队。
在国外，人们常常对这位年轻的科学家表示惊叹和好奇，罗锐邦说：“人们总是先知道
我的年龄，后知道我的姓名。他们不相信像我这样大学还没毕业的学生能成为一名合格
的科学家。”
事实恰好相反，在过去的一年里，几乎所有华大基因在顶尖科技杂志上发表文章的作者
名单上都有他的署名。
华大基因陆续完成了水稻、家鸡、家蚕、黄瓜、马铃薯、2008年奥运吉祥物熊猫晶晶、
格陵兰岛古人、人体肠道基因组等一系列计划。华大基因人充满雄心壮志，准备大干一
场。依靠一群年轻的生物信息学家和超现代计算机，每月能够产出3兆DNA数据。此外，
华大基因购买了128台Illumina公司生产的最新型测序仪，每台每天能够产生250亿碱基
对。如果所有的仪器一起开动，中国的数据量将使美国黯 |
|
i*s
发帖数: 3 | 6 128台Illumina公司生产的最新型测序仪，每台每天能够产生250亿碱基
对 |
|
p****n
发帖数: 9263 | 7 钱未必付了吧？
技术进步还真快，杨矮子起家时候就两台测序仪，每天能做20来块96孔板，每孔能读出
400来个碱基，
就敢揽那1%的活，牛逼啊 |
|
b******n
发帖数: 4225 | 8 “最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列”
你看看两端跟你的引物有没有部分相似性
其实PCR引物如果3'末端有13个左右碱基相同就有可能P出来的（Tm值不够高的话）
另外你使用BLAST中间的Somewhat similar sequences (blastn)选项
而不是缺省选项megablast |
|
W*********e
发帖数: 247 | 9 能问下你们的突变是怎么做的, 都是变成Ala? 可以把有相互作用的一对碱基的侧链都
突变成Asp或者Glu试试. |
|
E*******2
发帖数: 131 | 10 我正在做ChIP-qPCR， anti acetyl Histone H3 and H4, 将来也会考虑做anti
methylation histones，现在遇到的问题
是，找不到合适的control gene primers. Millipore 公司提供的chip kits里用的
GAPDH。 但是我们领域有几篇文章是用
的beta globin和beta tubulin。我的老板说用我们领域已发表的。然后我查了一下他
们用的primer sequences，有意思的
是他们用的是小鼠，但是primer sequences和大鼠的基因是完全匹配的，而和小鼠有1
－2个碱基不匹配。并且beta
globin的primer在大鼠基因中扩增的是hemoglobin epsilone2，而在小鼠中最可能扩增
的是hemoglobin y， beta－like
embryonic chain。 我的问题是，如果我选择beta globin做为我的control gene，我
是否应该重新设计primer，还是说
我可以直接用人家发表的primer sequence？但是他们用的是sybr |
|
E*******2
发帖数: 131 | 11 谢谢你，我觉得我把不配对的1，2个碱基更正过来附和小鼠基因顺序应该就可以用了吧
，毕竟两个不同国家的实验室都用
过发表过。另外我学着用相关程序检验了一下，符合我们要求
take
okay.
several
think |
|
v***a
发帖数: 1242 | 12 拿有我insert DNA的plasmid去测序，用的是在vector上的primer（在insert的两边）
来读序列（是测序公司提供的T7和T3 primer），结果insert的头和尾总是有大概15～
20个bp读不出，都是N（我的insert有1.5kb左右），不知道这个问题该怎么解决好？
还有一个问题，发现这个plasmid在insert DNA的大约970bp处有一个碱基突变，由A/T
突变为G/C，就这一个不符，不知道这个是因为什么原因呢？
谢谢高手们回答吖 |
|
v***a
发帖数: 1242 | 13 谢谢你啊
我用的是测序公司直接提供的T7 primer，序列是在vector上的T7 Promoter区，在我
insert之前大概20bp左右
你的意思是我自己再设计一个在vector上比T7更加前的引物么？
我用sense和antisense的primer来测，都发现这个碱基不对，看来真是突变了。。。 |
|
d***y
发帖数: 8536 | 14 第一个问题：几十个碱基在测序的时候missing是正常的， 你需要重新自己设计
primers， 与目的序列的距离拉开。
第二个问题： 判断是否突变，你需要打开源文件， 查看出峰的情况，有时候峰的叠加
之类的情况会导致误读，形成突变。 如果真的是突变，建议你重新做。 |
|
s********l
发帖数: 58 | 15 请教一下大家，我们一直用psuper的shrna系统，它的target是基因上的19mer的序列，沉默某基因
的效果不错，现在想用另外一个系统来沉默这个基因，这个系统target基因上的21mer的序列，能否把19mer添加两个碱基？
怎么添加成功几率比较大？ |
|
n***w
发帖数: 2405 | 16 我正在做一个fusion protein，我就是设计引物，然后p。。。引物大概35个碱基吧。
。。overlap。。。还是比较好p的。。。 |
|
x*****e
发帖数: 309 | 17 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
|
j***a
发帖数: 2 | 18 不好意思，没有表达清楚。不是100 +100， 有10个重叠碱基的 |
|
p****s
发帖数: 3153 | 19 tRNA和密码子的相互作用是纯粹的碱基配对，原理是氢键，没有核糖体检查一说吧
还不如去搞AA-tRNA synthetase |
|
l******u
发帖数: 936 | 20 现在的 4Pi 显微镜理论上可以做到碱基之间的分辨率, 但是实际上有些困难,
但是这些东西在immaging技术牛逼后, 迟早可以解决. |
|
z**********8
发帖数: 766 | 21 感谢各位热心！
PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
谢谢！ |
|
o******n
发帖数: 511 | 22 没找到,都是收费的.如果自己把反向引物测出来的序列弄个reverse complement然后比
对感觉不可靠. 有什么免费软件可以生成contig?
sanger测序问题:
用模板加引物,理论上测出来的序列是从引物后面第一个碱基开始显示,但实际又往后隔
了好远,这样正常吗?
谢谢~~~ |
|
k*********u
发帖数: 614 | 23 请问下
大约20个碱基的引物 一般级别就好
大概多少钱？
请推荐几个公司
谢谢了！！！ |
|
m***n
发帖数: 536 | 24 现在我们想检测转染细胞后到底有多少exogenous micro RNA和protein of interest结
合（比较在不同条件下结合量的差别）。
请问有谁做过这个？micro RNA很短，只有20多个碱基，这个PCR的原理是什么？具体怎
么设计引物呢？
商业化的kit里都有设计好的引物甚至RT的引物。就是不太明白整个的原理，和传统PCR
的区别是什么？ |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 25 有个4kb的片段比较难amplify
好不容易折腾得可以P出来了
然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
5'端好几次都给我奇怪的结果：
amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
所以能看到back bone）：
5'TTAGGCCGGCC.....
我得到的就是这样：
5'GCCGGCC......
本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
直接导致一个限制性酶切位点不完全
primer是IDT定的
从IDT订过可能有上千的primer，从来没有遇到过这样的情况
现在我不知道是primer的问题还是有什么别的原因
版上有人遇到过么？
当然我准备定新的primer看看有没有帮助
不过还是百思不得其解这是怎么回事啊 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 26 我给出的不是紧挨着测序引物的部分
测序是从insert上下游比较远的地方（>60 bp）开始测的
所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC，现在只有GCCGGCC，所以
不切（已经试
验过，而且酶是好的，另外也做过实验跟甲基化没有任何关系） |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 27 呃，这个倒真没查
会查一下
不过还是准备重新定primer
再多加几个碱基 |
|
g******1
发帖数: 244 | 28 他要加至少6个碱基进去，用mutagenesis恐怕不行吧 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 29 版上有前辈用AGEI这个酶做过单酶切么？
最近正在用它，出现大量tricky的情况，请问这个酶有什么忌讳么？
另外，网上也找不到它的保护碱基的设计信息 |
|
i*****i
发帖数: 30 | 30 首先问楼主
1.PCR出来有条带吗
2.是双酶切吗，单salI必须去磷酸化，引物有保护碱基吗 |
|
v***a
发帖数: 1242 | 31 PCR check看不到任何条带
是双酶切，用的另一个是MluI，引物前都各加了2个保护碱基
期待高见 |
|
p*********g
发帖数: 9527 | 32 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: cdlqin (cdlqin), 信区: Joke
标 题: 生物学男的一个梦（转自开心）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 12 09:00:09 2010, 美东)
房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。 大理石地砖，波
斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，地面，桌面，全
采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，烧碱，双氧水，
换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当然是花钱雇人刷
，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N 间房的地板了，看见国产玻璃细胞培养瓶
就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL
以下的是佐料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工
艺。国产玻璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）玻
璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。
... 阅读全帖 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 33 我觉得光靠几个碱基的预测多数都是YY，还是要结合全基因组的ChIP-seq啊。 |
|
m*********7
发帖数: 606 | 34 首先，你有没有确定这个菌的chromosome有多大？有没有你这两个酶的酶切位点？
其次，按照识别位点6个碱基来算，4096个bp才能随机出现一个EcoRI的位点，考虑正反
向的话减一半就是2048bp。你跑胶的浓度是否合适来区分切开和没切开的状态？
你的描述中并没有出现非酶切对照，你是如何判断没切开的？
另外，你的实验目的是什么？为啥要用这两个酶来切？ |
|
b*******6
发帖数: 39 | 35 我4个月前硕士毕业来德国
一个挺好的大学 拿的是老板给的奖学金 不是国家奖学金
老板是我们这行的大牛 说实话 人也不错
刚开始的课题1个是克隆，把一个蛋白加上不同的tag插到pQE8或者pQE60的载体里面去
载体选的位点是BamH1和Hind3，片段的酶切位点用的是Bgl2（因为片段里面有BamH1位
点）和Hind3，因为要在N段和C段加上10+aa大小的tag，所以一般引物都很长，50-80bp
本来想用pQE9而不是pQE8，但实验室里面没有9，BamH1和Hind3在8里面中间就隔了1个
碱基
第二个课题是用Dpn1酶构建不同的突变株
用pQE8的那个载体死活折腾不出来，前前后后大概4个月，另外2个倒是很顺利
第一次和老板谈活是在来这边3个月后，他说我是来读博士的，不应该在克隆这种小事
上折腾，应该很简单；第二次，就是昨天，他看到我pQE8最后一次克隆的结果：仅有几
个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。然后就发火了，叫我2个月以内结束实验室
课题走人。
来这边4个月，除了开始阶段适应外，基本上... 阅读全帖 |
|
y**********o
发帖数: 37 | 36 前面有人提到了你用的两个酶切位点在载体上只隔了一个碱基,这种情况下载体双酶切
效率是很低的.
另外不知道你想加什么Tag到你要表达的蛋白上?如果是常见的FLAG和Myc这些,可以用个
笨点的方法,clontech有很多带Tag的表达载体,先把cDNA插到这些载体上,然后再用另一
对引物PCR扩带有Tag的蛋白序列.如此一来就避开了你的引物过长这个问题.并且只需要
做最常规最简单的克隆,只是在载体和酶切位点的选择上需要多花点时间验证. |
|
n********k
发帖数: 2818 | 37 仅有几
个克隆，送过去测序，要做的8个构建株里面只有一个对的，其他基本上都是在Bgl2那
一段的引物地方要么有突变要么就是缺失。
well, could you start with these wrong ones now and just do some mutagenesis
, like you did with dpn1 ones...it would be much easier if it were due to
digestion/ligation etc...but it won't solve the problem if your fragments
are toxic or have too many repeats etc...It is a bit strange that it only
happen to your primer region in all the constructions though...if it is
toxic or due to recombination, it could happen to any regions or... 阅读全帖 |
|
b*******6
发帖数: 39 | 38 pQE703个酶切位点间好像有好多碱基，但是不管这个。你是说这样改造吗？ |
|
s******s
发帖数: 13035 | 39 酶在不喜欢的环境里面干什么谁也不知道，比如加几个错误的碱基啥的 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 40 Tm计算方法常用的分两类，一类是只根据不通碱基的数目和比例，自然很不准确了，其
他的属于thermodynamic methods，例如nearest-neighbor method，还考虑盐浓度以及
引物浓度的影响。不同方法之间相差10度自然是可能的。
对于qPCR引物，一般参考你所使用的PCR试剂的说明，根据其反应体系以及你所使用的
引物浓度来确定Tm值和退火温度。Roche和ABI都有专门的工具来计算相应的数值。
保险的话，分别设计两对，标品做个标准曲线，孰优孰劣自然分晓。 |
|
S*********g
发帖数: 24893 | 41 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
我是不是应该转回bioinfo？ |
|
x**e
发帖数: 163 | 42 利用任意15个碱基重组反应来克隆片段到载体，看起来很不错。不知道用过的人评价如
何？ |
|
f****n
发帖数: 114 | 43 小弟最近在做RNA in vitro transcription，用的是ambion 的MEGAscript kit。
可是不论是用PCR产物直接做模板，还是连接到质粒上再线性化做模板，都得不到sharp
的条带，size比预期小很多并且有拖尾，但kit里阳性对照可以出来。
已经排除了RNase污染。估计是DNA模板纯度的问题，请问各位PCR产物用啥方法纯化？
另外，我在T7promoter序列前面加了7个碱基，难道是这个影响酶的效率？
请各位高手帮忙！ |
|
f****n
发帖数: 114 | 44 谢谢！
sense primer有45bases，primer序列也有影响？
T7promoter前面需要加6-10个碱基么？我看promega的手册上这样建议，但有些paper直
接用T7promoter最小序列 |
|
S******e
发帖数: 393 | 45 我以前用pfu也碰到过同样的问题, 当时是扩4kb的片断，测了几个克隆，
其中一个克隆中间少了大约五六十个碱基, 很奇怪，也不知道是什么原因 |
|
g*********d
发帖数: 233 | 46 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰... 阅读全帖 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 47 没试过。不过不太建议这么做，合成100bp以上的引物应该不便宜吧。
要是我的话，就直接在primer上加上酶切位点和保护碱基，做普通的PCR。另一部分直
接合成两条Oligo退火（参考构建shRNA），然后与酶切后的PCR产物，酶切后的载体一
起去做链接，一次就能搞定。 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 48 是知道的基因，有想法。但是一个基因也很长吧？现在有几个病人要测。病人能活肯定
是heterozygote，再加上一些正常的polymorphism，一般测序不会有问题么？我刚测了
四只老鼠的1000bp的一段序列，觉得很多碱基都不清楚都需要自己再回过头来看，如果
整个基因加上两边一点疑似调控序列都测的话，挨个做pcr再测序再自己拼基因是不是
太费时间了呀？
如果普通seq测下来这个基因要是没有突变怎么办，NGS的话我们可以综合考虑一下。不
知道我这个想法可行不可行。
我们现在想评估一下这个测下来的时间和花费，如果真要做工资成本也要考虑进去，因
为如果普通测序自己拼图我肯定会推掉的。如果NGS我倒是想学一下。到时候出paper随
便吧，我要是有时间就弄个草稿，要是没有时间我共同一作放后边也无所谓。 |
|
s********r
发帖数: 312 | 49 纯粹作为一个数学问题的话，你这个问题问的太含糊。比如在最开始这个population里
面基因序列的初始状况是什么样的，还有你定义的最小重组单位是多少，难不成相邻的
两个碱基的重组概率也算进去？一个比较简单的scenario是，一对父母，不停的生啊生
，什么时候生出两个一样的孩子 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 50 作为还没有什么太多实践idea的机会的人，在这里胡诌几句吧。上面的回帖是实验的小
间隙，现在是个大间隙。。。
不知道你说的idea是哪个层次上的。我很多大而无当的idea的来源还不是paper。我作
为懒人，吸收的是科技新闻层次的东西多。比如自己订了生物谷的新闻rss和pubmed的
rss，汉语的坚持看，看到有趣的paper的时候就看看abstract，英语的攒了上百条。。
。CNS都有podcast，这种可以边走边听，但是某某蛋白的某碱基突变这种信息是永远记
不住的，记住的是如果阻碍了神经细胞的什么过程的话，那么什么激素就会受影响了。
然后就可以天马行空的想，阿，是吗，那这个激素，不是也影响干细胞的神马么，那么
这个神经细胞是不是跟干细胞也有联系？？？（这段是瞎扯的随便举个例子）。当然如
果真的是极度相关的东西还是会找原文来看，但是大部分就随便听听就过去了。不过有
时候这种东西听多了，别人闲聊跟自己无关的课题的时候，有时候也可以插上话，你说
的那个什么abc，不是也调控xyz么？有时候能显得见多识广，但是自己知道其实是半瓶
子醋。。。
小的真的能用的idea，我为神马想不起来例子。... 阅读全帖 |
|
