f****n
发帖数: 114 | 1 小弟最近在做RNA in vitro transcription，用的是ambion 的MEGAscript kit。
可是不论是用PCR产物直接做模板，还是连接到质粒上再线性化做模板，都得不到sharp
的条带，size比预期小很多并且有拖尾，但kit里阳性对照可以出来。
已经排除了RNase污染。估计是DNA模板纯度的问题，请问各位PCR产物用啥方法纯化？
另外，我在T7promoter序列前面加了7个碱基，难道是这个影响酶的效率？
请各位高手帮忙！ |
o********y
发帖数: 87 | 2 Qiagen PCR clean up kit
sharp
【在 f****n 的大作中提到】
: 小弟最近在做RNA in vitro transcription，用的是ambion 的MEGAscript kit。
: 可是不论是用PCR产物直接做模板，还是连接到质粒上再线性化做模板，都得不到sharp
: 的条带，size比预期小很多并且有拖尾，但kit里阳性对照可以出来。
: 已经排除了RNase污染。估计是DNA模板纯度的问题，请问各位PCR产物用啥方法纯化？
: 另外，我在T7promoter序列前面加了7个碱基，难道是这个影响酶的效率？
: 请各位高手帮忙！
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f****n
发帖数: 114 | 3 我用的切胶回收 然后QIAquick Gel Extraction Kit
【在 o********y 的大作中提到】
: Qiagen PCR clean up kit
:
: sharp
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m******5
发帖数: 1383 | |
a****k
发帖数: 1130 | 5 这个kit用过之后对transcription很不好
我一般都是尽量保证PCR的质量，run 1ul检测一下之后就直接用PCR product做，不会
经过任何gel purify的过程
【在 f****n 的大作中提到】
: 我用的切胶回收 然后QIAquick Gel Extraction Kit
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V********n
发帖数: 305 | 6 用过这个KIT。看了一下以前的记录，俺用PCR产物，经胶纯化后（切胶，乙醇沉淀，洗
，干燥，重悬）做模板。俺觉得是模板设计的问题。建议检查一下序列里是否有其他
promoter sequence或者stop codon。还有就是你合成的序列是否过大？ |
f****n
发帖数: 114 | 7 谢谢！！下次我也试试你的方法。
【在 a****k 的大作中提到】
: 这个kit用过之后对transcription很不好
: 我一般都是尽量保证PCR的质量，run 1ul检测一下之后就直接用PCR product做，不会
: 经过任何gel purify的过程
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f****n
发帖数: 114 | 8 谢谢！
sense primer有45bases，primer序列也有影响？
T7promoter前面需要加6-10个碱基么？我看promega的手册上这样建议，但有些paper直
接用T7promoter最小序列
【在 V********n 的大作中提到】
: 用过这个KIT。看了一下以前的记录，俺用PCR产物，经胶纯化后（切胶，乙醇沉淀，洗
: ，干燥，重悬）做模板。俺觉得是模板设计的问题。建议检查一下序列里是否有其他
: promoter sequence或者stop codon。还有就是你合成的序列是否过大？
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M*****n
发帖数: 16729 | 9 repurify your PCR product and use RNase-free water. |
