C*******e
发帖数: 4348 | 1 有个4kb的片段比较难amplify
好不容易折腾得可以P出来了
然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
5'端好几次都给我奇怪的结果：
amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
所以能看到back bone）：
5'TTAGGCCGGCC.....
我得到的就是这样：
5'GCCGGCC......
本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
直接导致一个限制性酶切位点不完全
primer是IDT定的
从IDT订过可能有上千的primer，从来没有遇到过这样的情况
现在我不知道是primer的问题还是有什么别的原因
版上有人遇到过么？
当然我准备定新的primer看看有没有帮助
不过还是百思不得其解这是怎么回事啊 |
c******r
发帖数: 3778 | 2 嗯，可能原因比较多。
1. 不知道你的primer有多长？有没有HPLC purify？如果cloning可能仅仅desalt是不
够的，尤其是比较长的primer。但是5'少掉比较奇怪，一般合成都是3'少掉几个？
2. 不知道你用的什么polymerase？会不会有5’exonuclease activity？
要不你试试随便加4个base pairs再做一下，就算再少4个base pairs也没关系了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有个4kb的片段比较难amplify
: 好不容易折腾得可以P出来了
: 然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
: 5'端好几次都给我奇怪的结果：
: amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
: 所以能看到back bone）：
: 5'TTAGGCCGGCC.....
: 我得到的就是这样：
: 5'GCCGGCC......
: 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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l*****i
发帖数: 1163 | 3 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果，或者结果不可信。不知道你的测序结果
里面是否可以看到TOPO II的部分序
列。
我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
思？不能切开还是不能完全切开？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有个4kb的片段比较难amplify
: 好不容易折腾得可以P出来了
: 然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
: 5'端好几次都给我奇怪的结果：
: amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
: 所以能看到back bone）：
: 5'TTAGGCCGGCC.....
: 我得到的就是这样：
: 5'GCCGGCC......
: 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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l*****a
发帖数: 1431 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 5 我给出的不是紧挨着测序引物的部分
测序是从insert上下游比较远的地方（>60 bp）开始测的
所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC，现在只有GCCGGCC，所以
不切（已经试
验过，而且酶是好的，另外也做过实验跟甲基化没有任何关系）
【在 l*****i 的大作中提到】
: 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果，或者结果不可信。不知道你的测序结果
: 里面是否可以看到TOPO II的部分序
: 列。
: 我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
: 思？不能切开还是不能完全切开？
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 你遇到这种情况也是5'端少而不是3'端少么？
在 lischka (smiling cat) 的大作中提到: 】 |
l*****i
发帖数: 1163 | 7 这种情况应该是引物有错误，测序不太可能出错，因为你酶切的结果也支持这点。如果
你实在还不放心，你可以在4kb片段
上设计一个测序引物，反向测序这个区域。
看来你得重新合成引物。看能不能在这4kb中找一个酶切位点（只要这个酶切位点和TPO
或者你的目的载体兼容即可），这
样你就不用再次扩增4kb那么大的片断。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我给出的不是紧挨着测序引物的部分
: 测序是从insert上下游比较远的地方（>60 bp）开始测的
: 所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
: 我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC，现在只有GCCGGCC，所以
: 不切（已经试
: 验过，而且酶是好的，另外也做过实验跟甲基化没有任何关系）
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 谢谢建议
我肯定会重新订引物的
我没有怀疑过测序出错
扩增的4kb片段上设计引物测序比较不可行
这个说起来就话长了
引物都有的
但是因为这个4kb片段比较特殊
没有办法从里面测序
TPO
【在 l*****i 的大作中提到】
: 这种情况应该是引物有错误，测序不太可能出错，因为你酶切的结果也支持这点。如果
: 你实在还不放心，你可以在4kb片段
: 上设计一个测序引物，反向测序这个区域。
: 看来你得重新合成引物。看能不能在这4kb中找一个酶切位点（只要这个酶切位点和TPO
: 或者你的目的载体兼容即可），这
: 样你就不用再次扩增4kb那么大的片断。
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c******r
发帖数: 3778 | 9 你有没有verify一下tube的label上有没有漏掉4个base pairs？
我觉得可能是primer漏了4个base pairs
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢建议
: 我肯定会重新订引物的
: 我没有怀疑过测序出错
: 扩增的4kb片段上设计引物测序比较不可行
: 这个说起来就话长了
: 引物都有的
: 但是因为这个4kb片段比较特殊
: 没有办法从里面测序
:
: TPO
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 呃，这个倒真没查
会查一下
不过还是准备重新定primer
再多加几个碱基
【在 c******r 的大作中提到】
: 你有没有verify一下tube的label上有没有漏掉4个base pairs？
: 我觉得可能是primer漏了4个base pairs
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l*****a
发帖数: 1431 | 11 对，是5’端少的，linker没了。作PCR看着是正确的条带，回收后作连接，怎么也连不
上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你遇到这种情况也是5'端少而不是3'端少么？
: 在 lischka (smiling cat) 的大作中提到: 】
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s******s
发帖数: 13035 | 12 长的引物错误是有可能的，我们当年也有一个Linker合成错了，
搞了两三个月才figure out是怎么回事
较远的地方，
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有个4kb的片段比较难amplify
: 好不容易折腾得可以P出来了
: 然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
: 5'端好几次都给我奇怪的结果：
: amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
: 所以能看到back bone）：
: 5'TTAGGCCGGCC.....
: 我得到的就是这样：
: 5'GCCGGCC......
: 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 ft，居然还有这种事情
我以为只有3‘会少
不过24nts就合成错也太搞笑了吧
唉
【在 l*****a 的大作中提到】
: 对，是5’端少的，linker没了。作PCR看着是正确的条带，回收后作连接，怎么也连不
: 上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。
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y******g
发帖数: 3 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 15 还真是不知道
这下明白了
【在 y******g 的大作中提到】
: 引物合成是从3’到5’的，现在明白了吧？
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b****r
发帖数: 17995 | 16 楼主记得回来讲讲，最后是不是IDT合成引物的问题？
你那测序结果后面的序列都对吗 |
b******n
发帖数: 4225 | 17 太长的引物容易出这种问题
有次我的几个引物（50-60nt）的5'都缺一个A
而我当时不知道，只按照25nm的scale合成
后来他们客服解释说合成时每一个nt正确添加的效率是99%
那么60个nt的引物合成下来最终产物中正确的只有55%
因为引物是从3'->5'合成的，所以5'很容易有deletion
他们建议超过60nt的引物合成使用100nm的scale（每步合成效率达到99.5%）
较远的地方，
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有个4kb的片段比较难amplify
: 好不容易折腾得可以P出来了
: 然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
: 5'端好几次都给我奇怪的结果：
: amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
: 所以能看到back bone）：
: 5'TTAGGCCGGCC.....
: 我得到的就是这样：
: 5'GCCGGCC......
: 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
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s*****k
发帖数: 2297 | |
