z****g
发帖数: 3340 | 1 做ChIP有些年头了，最近遇到一个新问题。以前都是细胞在板上时做Fixation，然后从
板上刮下来做后续处理，一直很好。最近做一个很难从板上刮下来的细胞，就先用
Trypsin消化之后，把细胞放在大试管里象悬浮细胞那样做Fixation，然后离心作
sonication。但是好像结果不太好,会不会实验的顺序或者在试管里做Fixation不好.有
经验给说说. |
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d*******w
发帖数: 45 | 2 刚开始养一种需要在collage-coated的petri-dish上生长的细胞,trypsin之后,细胞变
圆,可是不论怎么冲洗,就是掉不下来,这种情况怎么办啊?现在暂时用刮下来的方法,感
觉效果不时很好. |
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s**e
发帖数: 1523 | 3 你可以试试加大trypsin的量，时间等长一点。。。 |
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w***a
发帖数: 4361 | 4 可以trypsin处理几分钟，然后PBS wash就行了。
macrophage贴壁很紧的，只能用scraper刮。 |
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z****g
发帖数: 3340 | 5 我是必须用trypsin digestion，或其他消化酶。 |
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c********8
发帖数: 350 | 6 I am not sure Trypsin influence the downstream operation, but you can use "
cell dissociate solution-non enzymatic". |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 NO. Trypsin is a protease and won't bother with RNA.
Also, in most RNA extraction kit, there will be a step to denature all the
protein, that includes protease. |
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j********r
发帖数: 156 | 8 Can i ask a question?
Primary MEFs (p2) were infected with lentivirus (FUW-OSKM, the one made by
the mit group) twice, and on
the third day trypsinized and seeded at low density on rMEF seeder cells.
Cells were then incubated with
knockout-serum replacement (ksr) medium supplemented with LIF and others,
medium was refreshed every
two days. Now it is about 2 wks after the initial infection, there is no ES-
like colonies in the well, but many
round single cells. Having no idea what to do next, app |
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s*****y
发帖数: 55 | 9 我记得是需要加一定量的trypsin把HA0切切病毒才能贴到细胞上去的 |
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p****p
发帖数: 3360 | 10 膜蛋白疏水氨基酸多，trypsin酶切的片断可能很大。质谱覆盖的范围相对要小，所以鉴定要难些。不知道有没有其他蛋白酶比较好得可以解决这个问题。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 没说是进入人体。说的是在肠道内
至于另外一位让我去改写生理卫生教科书的同学（不是你）。不好意思的说一句：
你对人体消化系统的所知仍然停留在中学的生理卫生教科书的水平。
人体消化系统针对于蛋白无非就是这个几板斧：
胃酸：这个很多蛋白都不敏感
蛋白水解酶：人体能分泌的无非就是 pepsin, trypsin and chymotrypsin
这个其实只能消化大部分蛋白，但是对于一些构型特殊的，或者是进行了修饰的
蛋白没有办法。
其实人体根本就不具备消化所有进入食道的蛋白的能力，只需要能将大部分
蛋白消化掉，能够产生足够人体使用的氨基酸就够了。假如人真的能够
消化所有的蛋白质的话，那么，首先，那些人分泌出来的水解酶自己就先
完蛋了。第二，人的消化系统就不会有任何寄生虫了。第三，那么就没有所谓
的肠道传染病了。第四，我们就不需要吃那么多饭了，苍蝇和狗也就不会吃人
的粪便了。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 12 Where do you get your HDACs? Also, which HDACs? The in vitro data for most
class IIa HDAC are wrong...including HDAC8. Class IIa and HDAC8 do not
deacetylate the acetylated substrate (or very little)...they do bind though.
I can give you an activity list...
Class I (Ac substrate)
HDAC3 > HDAC2 > HDAC1
Class IIa (TFA substrate)
HDAC8 > HDAC4 = HDAC5 = HDAC7 = HDAC9...
Class IIb (Ac substrate)
HDAC6 not so active but better than HDAC1
HDAC3 is at least x100 time more active than HDAC1/2 in vitr... 阅读全帖 |
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S*******m
发帖数: 34 | 13 You can save some time by adding plasmid mixture (immediately after
preparation) to trypsinized and resuspended 293T cells. Worked pretty
well for me.
To save some money, you can also prepare a batch of HBS with different
pH and test which one works best for you.
confluency
reach 40
fresh |
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A****w
发帖数: 244 | 14 跑个胶，拿出杂质蛋白，做个trypsin digested MALDI看看杂质是什么。
50%的soluble是不是分离的蛋白可能是聚集体？试试低温表达。
有loop不稳定结构，加arg+glu到buffer里，是不是可以增加蛋白的溶解特性。
暂时就想到这些。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 咦！你们也有这个经历啊？我三年前用的那个anti-FLAG(M2)很好使。
但是今年中间用了隔壁实验室新订的同样的抗体，就是怎么都没有特异信号，
后来只好悻悻的把三年前在－２０存起来的使用过的回收液拿来用，幸好
还可以。
我怀疑sigma 是不是他们的冷库出了问题？那么多不同的产品都纷纷的在今年
出问题？我们实验室另外一个人用他们的特异性水解酶，以前都很好用的，
最近订的一批突然就不特异了，放什么东西都噼里啪啦的全部切成了小肽，
简直就跟trypsin 差不多！
而且Sigma很讨厌的一点是他们从来都不会认错，打电话给他们抱怨的时候
态度傲慢得一塌糊涂，退款换货是没有的。
NND |
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G********e
发帖数: 528 | 16 我用过trypsin处理后的细胞悬液直接加LF的转染mix
没什么问题
我也用过带抗生素的media
也能有virus |
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s*****3
发帖数: 41 | 17 最近在用293T表达外源蛋白,然后用抗体检测蛋白表达水平。 不知道为什么细胞的
viability非常低，我用7-AAD 染色，viability只有50%。请教实验室前辈这可能是什
么原因导致的呢？
我通常 seed 293T cells the day before transfection at the density of 0.5
million/well (6-well plate).
In the afternoon next day transfect 293T cells with plasmids using FugeneHD.
About 36 hours later, detach cells with trypsin and then stain with the
primary antibody on ice for 30 minutes and then incubate with PE-conjugated
secondary antibodies on ice for 30 minutes. FACS analysis is done
immediate... 阅读全帖 |
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w********e
发帖数: 275 | 18 I'm not familiar with protein mass spec,I'd appreciate some help for a
question.
The protein samples was digested by trypsin, which cuts after K and R. But
why some peptide fragments follow amino acids other than K and R in the
result file? and the same fragment appears more then once. are those
fragments real?
Thanks a lot! |
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w********e
发帖数: 275 | 19 how do those non-specific cleavage happen? are they also cut by trypsin?
Thanks! |
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l****n
发帖数: 711 | 20 是来自trypsin。这些酶的特异性都一般，经常认错切割位点，在不该切的地方切一刀
。其他常用的酶（chymotrypsin, GluC, ...）也一样。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 21 mouse E14 细胞。
用.1%的gelatin处理培养皿，需要放置多久？有的protocol说室温1分钟，有的说至少
30分钟。
处理时间过久了会有影响吗，比如在incubator里面放过夜了？
要传代，用trypsin消化下来细胞，是不是原来的培养皿就不能用了？
谢谢！ |
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q*****n
发帖数: 331 | 22 My personal experience:
neo and puro are good, quick selection.
Hygro is OK, but kill cells slowly.
Zeo is the worst, even zeo resistant cells have funny shapes. After a few
days of selection, you have to trypsinize cells off the plates and replated
cells without zeocin. Only zeo resistant cells will survive and grow. |
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m**********d
发帖数: 137 | 23 我们实验室也发生过类似的情况，最后证明是yeast contamination，用以下的
protocol很快就解决问题了
13ml complete culture media + 100-500 microlitter amphotericinB(depend on
your cell line) + 1ml pen/strep antibiotic
treat之后你在显微镜下能看到黑点死了漂起来，大概treat3-4d, trypsinize,
replate之后就很干净了，不放心的话再做一下hoechst staining。 |
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t**j
发帖数: 10 | 24 Why not stain cells with dyes that detect dead cells? alternatively, the
simplist way is to trypsinize the cells after drug treatment and count cells
in the presence of trypan blue, when dead cells turn blue. Do the same to
the control cells that are the same confluent. |
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y********g
发帖数: 22 | 25 treat the proteinA pd with trypsin digestion, then determine the mass of
fragments by mass spec. if bcd are not too big, chances are you can map the
sequence of each component. even the map is incomplete, you;ll still know if
the pd contains b, c or d. |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 有些细胞就是喜欢结成团的，比方说有些内皮细胞，或者某些癌症细胞。
对此要么就是听之任之，要么就是用trypsin 处理，然后用那种30um 的滤网过滤
and |
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W*********n
发帖数: 775 | 27 please help me to have a look at the whole protocols and give some
suggesitons:
1) get 50midguts (about 3000cells/midgut, so about 1,500,000 cells or 80ug
protein totally),add 80ul lysis buffer (8M Urea, in 1XPBS, pH=8) including
Protease inhibitor and phosphatase, ultrasonic for 15-30 sec, then votex for
1 min. centrifuge for 10min at 14,000g and take the supernatant, add 16ul
5X loading buffer and heat for 20--30 min at 60 degree. load gel at 30ul/
lane and run for 2cm(for each sample, run th... 阅读全帖 |
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a******7
发帖数: 7936 | 28 单细胞都怎么抓的？
是单克隆么？
我用trypsin消化了数一下浓度，然后0.2cell/well种到96孔板里，过一天检查，只留
有一个细胞的孔。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 29 1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
2. 含量越低，越不容易检测到
3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾 |
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K******S
发帖数: 10109 | 30 It depends on your protein's amino acid sequence and what kind of enzyme you
use. For example, trypsin cleaves c-terminus of K and R (not if the
following amino acid is P) so you could get peptides with various length.
Each mass spectrometer has its own mass range that will determine how big/
small it can detect. And if you use LC-MS/MS instrument, the analytical
column also contributes to the detection. C18 columns can't retain
hydrophilic peptides very well. |
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K******S
发帖数: 10109 | 31 Here's my understanding: peptidome is the result of different proteolytic
enzyme activities. For traditional ID, you need to specify what enzyme you
are using in the search algorithm. such as trypsin, then the search
algorithm will look for K/R ending peptides to match. For peptidome, you can
ask the algorithm to search the entire database without any enzyme
restriction (It's gonna be a long search). then you can get some ladders of
peptides, I think you might be able to get some information by ... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 我没有做过血细胞分化啊，所以困惑的来问一下啊，
如果不加半固体培养基的话，乐意贴壁的细胞贴到培养板的底部不就完了么？
然后收集的时候先吸走液体，就把那种不贴壁的细胞移走了，然后再用trypsin
处理，不就把贴壁的细胞收集下来了么？
而且如果要直接在板上观测的话，多了那个半固体培养基反而麻烦，因为对焦
很麻烦的。
当然用半固体培养基的一个好处就是所有的细胞都不贴壁，可能在收集的时候比较
好办吧？但是如果不小心的话会把培养基什么的也收集下来，会很讨厌吧？
所以我奇怪的问一下，为什么一定要用这个半固体培养基啊？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 嗯，有道理。那种即使是不喜欢贴壁的细胞，在半固体培养基上也可以固定在
一个具体位置上吧？
我还有一个好奇的问题是，你们做血液培养的人，万一需要换培养液的时候怎么避免把
细胞吸走？
我能不能再问问你们在那个半固体培养基上收集细胞的时候，需要加trypsin 么？
的细 |
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h****k
发帖数: 182 | 34 流式经常堵，使用过bleach, trypsin处理还是没解决问题，打算用Dnase尝试下。问下
班上有人用过这个吗？浓度该用多少比较合适？100ug/mL? |
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h*****t
发帖数: 1226 | 35 You can reduce the protein, digest with lys-C or trypsin, deglucosylated
with PNGase F, then run LC-MS/MS, data base search to see if you can see any
protein Identified. |
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k******0
发帖数: 1073 | 36 谢谢建议。
我的想法是如果结合位点更多的话，需要更多的能量to disrupt the protein
interactions. 我有最少结合位点complex作为对照。
我不知道if there is a thermo effect.
我的结合蛋白太小了，只有15kDa，K and R rich， 进行trypsin limited digestion
好像不好用胶检测。没有MS仪器。
有没有什么光谱检测可以快速检测蛋白质相互作用情况？ |
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n*******n
发帖数: 515 | 37 版上高手众多，如果知道答案，不吝赐教。
我是做有机合成的，平时也会养一些细胞, 主要是cancer cell lines。
这次被老板指派了一个project需要primary neuron cells。这可从来没做过，试了几
次，可每次harvest neuron cells用trypsin或是scraping的话要不然下不来，要不然
百分之六七十的细胞已经挂了。。。
请有经验的同学指点一下吧，有包子。谢谢 |
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a*******o
发帖数: 16 | 38 1.用乳腺细胞做mamospehre的话，如果接种密度过大，相邻的细胞融合的话，会对形成
的sphere的性质有影响么？
2.为什么用trypsin消化mamosphere之后重新进行贴壁培养，有大量的细胞无法贴壁而
死亡 |
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f*********8
发帖数: 129 | 39 用pipette tip? 需要加trypsin吗？
多谢 |
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f*********8
发帖数: 129 | 40 谢谢，再问一下
有哪里需要加trypsin，还是直接用tip刮下来，放到dish里？这样长会均匀吗？ |
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c****g
发帖数: 93 | 41 在cell room连续折腾8个小时用了4盒tips耗尽50ml的trypsin之后，我忽然觉得我就是
一干活的machine，sigh～
深夜上来发个牢骚。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 每碟之间的细胞系和处理方法不同，所以必须不停的换pipet和玻璃吸管，
不能同一个用到底。而且还得不停的trypsinize /split 源细胞不能让他们长
得太满。每次换完液都制造出整整一个垃圾筒的废物出来，每次想起都觉得
特别不环保 :( |
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t****p
发帖数: 1504 | 43 如果你的细胞需要trypsinize，我觉得结果肯定变化无常。 |
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t****p
发帖数: 1504 | 44 生物学中让人头痛的地方就是这种情况，想做定量，但是varyation太大，不知道是否
该相信。
做过一些迁移的实验，多说两句。
1 transwell assay: 细胞状态很重要。你如果是贴壁细胞，trypsinization时间的些
微差别，离心重悬吊强度就有影响。另外我非常怀疑公司的产品是否能够做到不同孔的
膜都做得一样。
2 in vitro wounding assay：就是贴壁细胞划线，然后在特定时间看迁移到细胞所覆
盖的面积。此assay对medium的成分非常灵敏，要严格按照别人的protocol来做。换个
medium结果竟然会相反！你说该信哪个？此assay的定量分析非常耗时。
3 needle assay：就是一个小needle尖头释放chemoattractant，然后用软件实时记录
每个细胞的迁移，运算得到迁移速度和角度。模式生物Dictyostelium做这个assay的时
候需要先polarize才能迁移。很多文章说某个突变体影响力迁移速度。问题是很多突变
体本身它没法被polarized。你说究竟是它的极化能力受到影响还是本身的迁移受到影
响呢？曾经给c... 阅读全帖 |
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s*********t
发帖数: 600 | 45 终于遇到传说中的支原体污染了，郁闷到吐血 。。。
准备养很多很多细胞做蛋白纯化的，养到一半状态越来越差，无数死细胞漂着，细胞瘦
瘦的，很多小泡泡。PCR检测是支原体污染了 。。。。
扔掉了50个15cm的dish的ES细胞 。。。。
浪费了好多试剂和时间啊。
请教到底该怎么避免支原体污染？是不是我操作的时候不小心？要注意哪些事情？
我看实验室还有人不带手套伸进超净台传细胞呢 。。。
我还需要扔掉哪些东西啊？培养基，trypsin，gelatin，都需要扔掉吗？ |
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h*****G
发帖数: 113 | 46 hello,
最近需要用cell surface marker 细胞染色，sort positive 的细胞，然后重新plate
培养。每次sort完细胞，重新plate以后，细胞总是大量死亡。希望大家有什么建议。
下面是我的protocol
Trypsin cells. Stop reaction. collect cells. Wash once with PBS+0.2% BSA.
Staining cells in the dark at RT for 25 min. Staining buffer: PBS (w/o Ca2+
Mg2+) + 0.2% BSA+ 0.09% NaN3.
Wash three twice. (500gX5 min every time)
Resuspend cells in Staining buffer. Sort cells..
Replate positive cells. |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 ft, 都RNAlater了，基因表达还变个头啊。 RNAlater相当于fix了，
再变也就trypsin处理的时候变化2min，后面FACS完全无关 |
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o**d
发帖数: 3080 | 48 一般来说5mM的EDTA就可以搞定。
还有一种土办法：用注射器（10mL DMEM 无血清）附上25G（或更细）的针头，用力将
mf冲下来，这个要求手劲要大。如果还有很多粘附的，就再来一次，注意要换新的DMEM
。
做flow不需要太多细胞吧，不行的话换Trypsin也可以，反正你也不会再继续培养了。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 49 我有一个蛋白，考染都很清楚的带。
结果信号很差，他们说从胶上洗脱蛋白很难（或者电离很难，我不是很懂）。我是想看
整个蛋白分子量。
但是酶（trypsin）切过以后的小片段，据说很好做。
我对这不大懂，提供一点信息而已。 |
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i***0
发帖数: 160 | 50 转染48h后，转到100 mm plate上，加药，每三天换一次液，一至两周后去掉药，等细
胞长满，分到新的100 mm 板上， 一千，500， 200 个细胞/板， 观察单克隆， 用灭
菌滤纸（3mm直径）占trypsin用灭过菌的镊子夹着在单克隆上一抹，然后把滤纸放入新
鲜培养液中（24孔板），immunostain，WB，来确认单克隆的表达量和表达均一性。 |
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