m****M
发帖数: 360 | 1 IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
１。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
是否都能被检测到, 不管含量高低？
２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
不同酶消化的肽段拼接在一起）？
谢谢指点。 |
l******o
发帖数: 62 | 2 你最好是跑胶，然后让做质谱的人切带，in gel digestion。IgG 会严重影响其他蛋白
的鉴定。你想要的蛋白不一定所有序列都能检测到，不同的蛋白很不一样， 很多时候
可能只cover 20-40%的序列。
【在 m****M 的大作中提到】
: IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
: １。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
: 是否都能被检测到, 不管含量高低？
: ２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
: 不同酶消化的肽段拼接在一起）？
: 谢谢指点。
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I*****y
发帖数: 6402 | 3 IgG will screw up your MS - too much noise
【在 m****M 的大作中提到】
: IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
: １。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
: 是否都能被检测到, 不管含量高低？
: ２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
: 不同酶消化的肽段拼接在一起）？
: 谢谢指点。
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m****M
发帖数: 360 | 4 谢谢大家的指点。
是不是说蛋白含量很少的蛋白就不容易检测到。如果一个蛋白含量占主 （９５％，注
：不是IgG），另外一个蛋白占５％。这个蛋白我只能拿到最多６０％的序列？
最近从HEK２９３细胞里纯化蛋白，发现总有几个蛋白跟我的主要蛋白一起纯化出来。
跑native PAGE gel看不到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量比预测的大。但是跑变性胶
就可以看到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量和预测的一样大。对这些杂蛋白很感兴趣，
想知道是什么蛋白。
MS 是目前鉴定蛋白序列最牛X的方法了吧？
哪位给普及一下MS的优缺点？不胜感激
【在 m****M 的大作中提到】
: IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
: １。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
: 是否都能被检测到, 不管含量高低？
: ２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
: 不同酶消化的肽段拼接在一起）？
: 谢谢指点。
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s******s
发帖数: 13035 | 5 1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
2. 含量越低，越不容易检测到
3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾
【在 m****M 的大作中提到】
: IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
: １。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
: 是否都能被检测到, 不管含量高低？
: ２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
: 不同酶消化的肽段拼接在一起）？
: 谢谢指点。
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K******S
发帖数: 10109 | 6 You can have an estimated sequence coverage but that depends on lots of
factors. For protein ID, as long as you have 2-3 high confident peptides
matched, it's good enough for everybody (aka, any publications). In your
case, LC-MS/MS based methods will be better than MALDI based method. As
another ID mentioned, SDS gel with In-gel digestion is a pretty good
starting point.
【在 m****M 的大作中提到】
: 谢谢大家的指点。
: 是不是说蛋白含量很少的蛋白就不容易检测到。如果一个蛋白含量占主 （９５％，注
: ：不是IgG），另外一个蛋白占５％。这个蛋白我只能拿到最多６０％的序列？
: 最近从HEK２９３细胞里纯化蛋白，发现总有几个蛋白跟我的主要蛋白一起纯化出来。
: 跑native PAGE gel看不到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量比预测的大。但是跑变性胶
: 就可以看到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量和预测的一样大。对这些杂蛋白很感兴趣，
: 想知道是什么蛋白。
: MS 是目前鉴定蛋白序列最牛X的方法了吧？
: 哪位给普及一下MS的优缺点？不胜感激
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s******s
发帖数: 13035 | 7 补充一点割胶。
牛人直接割，我比较土比较懒比较慢，还想留个照片啥的，方法
SDS－PAGE直接夹玻璃纸中间干透了，加在实验记录本里面。 想起来的
时候可以拿出来拍张照啊，好好研究啊，用marker比在边上做记号啊，对
比一下对照考虑一下切几条带啊。
想起来要切的时候，用kimwiper70%酒精擦把表面擦干净了，用刀在干胶
上把要的条带切出来，放到epptube加点水，放几分钟就恢复了，用tip把
两面掉下来的玻璃纸碎片挑掉，离心把水去掉，就可以送去ms了
【在 s******s 的大作中提到】
: 1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
: 2. 含量越低，越不容易检测到
: 3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
: 4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
: 5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
: 6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾
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m****M
发帖数: 360 | 8 5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
What's the minimal quantity of protein for MS? What's your mean "liquid"?
must be in organic solvent? Thank you
【在 s******s 的大作中提到】
: 1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
: 2. 含量越低，越不容易检测到
: 3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
: 4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
: 5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
: 6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾
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m****M
发帖数: 360 | 9 Thank you for your suggestion.
How many amino acids I can get from one peptide? 10, 20 or 30 aa?
Thank you
【在 K******S 的大作中提到】
: You can have an estimated sequence coverage but that depends on lots of
: factors. For protein ID, as long as you have 2-3 high confident peptides
: matched, it's good enough for everybody (aka, any publications). In your
: case, LC-MS/MS based methods will be better than MALDI based method. As
: another ID mentioned, SDS gel with In-gel digestion is a pretty good
: starting point.
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m****M
发帖数: 360 | 10 直接TCA沉淀出我的蛋白混合物，可以拿去测序吗？还是必须事先消化一下？一个肽段
最多可以得到几个氨基酸的信息？
Thank you
【在 s******s 的大作中提到】
: 补充一点割胶。
: 牛人直接割，我比较土比较懒比较慢，还想留个照片啥的，方法
: SDS－PAGE直接夹玻璃纸中间干透了，加在实验记录本里面。 想起来的
: 时候可以拿出来拍张照啊，好好研究啊，用marker比在边上做记号啊，对
: 比一下对照考虑一下切几条带啊。
: 想起来要切的时候，用kimwiper70%酒精擦把表面擦干净了，用刀在干胶
: 上把要的条带切出来，放到epptube加点水，放几分钟就恢复了，用tip把
: 两面掉下来的玻璃纸碎片挑掉，离心把水去掉，就可以送去ms了
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b**y
发帖数: 70 | 11 上面有人已经说的很清楚了，就是ip后走sds-page，然后割带去做lc-msms，只要胶上
能看到条带质谱就能出结果。出了结果的情况下要用其它方法来验证是不是真的相互作
用。你上面提到的质谱的具体问题，一个方法就是去看基本的质谱的书或者找帮你做质
谱的人给你解释，都比在这问有效率。 |
K******S
发帖数: 10109 | 12 It depends on your protein's amino acid sequence and what kind of enzyme you
use. For example, trypsin cleaves c-terminus of K and R (not if the
following amino acid is P) so you could get peptides with various length.
Each mass spectrometer has its own mass range that will determine how big/
small it can detect. And if you use LC-MS/MS instrument, the analytical
column also contributes to the detection. C18 columns can't retain
hydrophilic peptides very well.
【在 m****M 的大作中提到】
: Thank you for your suggestion.
: How many amino acids I can get from one peptide? 10, 20 or 30 aa?
: Thank you
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s******s
发帖数: 13035 | 13 我都说了。这种东西太脏，拿去测出几十上百个蛋白你也不知道哪个是真的。
必须有好的control，然后并排SDS-PAGE，切胶去测
【在 m****M 的大作中提到】
: 直接TCA沉淀出我的蛋白混合物，可以拿去测序吗？还是必须事先消化一下？一个肽段
: 最多可以得到几个氨基酸的信息？
: Thank you
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m****M
发帖数: 360 | 14 非常感谢各位的热心帮助。原来只是知道MS，但是一点都不懂，也没有什么core
facility可以咨询。在大家的帮助下，基本上有点眉目了。下一步准备找公司给做后面
的。再次感谢大家的大力帮助。 |
X******n
发帖数: 914 | 15 最近Ｈａｒｐｅｒ发的几篇文章不都是in solution做出来的，难道都是垃圾？如果他
的那些文章要切胶的话，那不是要切死人？
用ｓｉｌａｃ会不会好一些？
怎样才能提高throughput的同时又不失准确率？
【在 s******s 的大作中提到】
: 我都说了。这种东西太脏，拿去测出几十上百个蛋白你也不知道哪个是真的。
: 必须有好的control，然后并排SDS-PAGE，切胶去测
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s******s
发帖数: 13035 | 16 没看过什么harper的文章。我这个是对新手说的，人家大牛，实验条件
摸得无比纯属，当然背景会少掉
【在 X******n 的大作中提到】
: 最近Ｈａｒｐｅｒ发的几篇文章不都是in solution做出来的，难道都是垃圾？如果他
: 的那些文章要切胶的话，那不是要切死人？
: 用ｓｉｌａｃ会不会好一些？
: 怎样才能提高throughput的同时又不失准确率？
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