s*****a
发帖数: 59 | 1 用的是pcDNA3，HEK293和600ng/ul G418
Transfection48小时后1:10 subculture开始做selection---P1
4days later, P1细胞confluent，开始subculture 到P2，split ratio 分别是1:10, 1
:30, 1:100, 1:300
10 days later, P2的1:10细胞也confluent，1:300细胞可以看到single colony，但是
比较密集不容易pick up。
我现在能不能用P2的1:10细胞再做一次1:100的subculture，等几天后看到比较分散的
colony后再做pick up? 这样是否相当于从P1开始1:1000 subculture？
但是另一个博后不赞同这样做，说这3周之中细胞已经transformed的很多，现在再做
subculture能拿到成功克隆的几率要比P1开始1：1000 subculture要小得多。请问大家
看法？
另外，同时做control的wt HEK293已经都死了。 | s******s
发帖数: 13035 | 2 那个啥，目的就是要挑抗性克隆么？不能直接dilute在96孔板么？为啥还要P1/P2/P3?
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【在 s*****a 的大作中提到】
: 用的是pcDNA3，HEK293和600ng/ul G418
: Transfection48小时后1:10 subculture开始做selection---P1
: 4days later, P1细胞confluent，开始subculture 到P2，split ratio 分别是1:10, 1
: :30, 1:100, 1:300
: 10 days later, P2的1:10细胞也confluent，1:300细胞可以看到single colony，但是
: 比较密集不容易pick up。
: 我现在能不能用P2的1:10细胞再做一次1:100的subculture，等几天后看到比较分散的
: colony后再做pick up? 这样是否相当于从P1开始1:1000 subculture？
: 但是另一个博后不赞同这样做，说这3周之中细胞已经transformed的很多，现在再做
: subculture能拿到成功克隆的几率要比P1开始1：1000 subculture要小得多。请问大家
| s*********r
发帖数: 22 | 3 我最近刚做的stable cell line , 用的是pCDNA3.1 载体
用的是zeocin筛选，不用G418.开始时候我自己用G418筛选， 老板告诉我是错的，要用
Zeocin筛选。
我尝试过转染293和293HK。
转染是regular钙转。 细胞密度是60%。转染后6小时就加药（也尝试过12小时）
zeoxin浓度是400ng/ml
基本上等conflent后，大概3-4天，1：2到2个100mm dish，5天后很多细胞死了，此时
转移到60mm dish，等single coloney . 然后等2周 ，看到很多coloney长出来， 然后
pick up到48-wells .
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【在 s*****a 的大作中提到】
: 用的是pcDNA3，HEK293和600ng/ul G418
: Transfection48小时后1:10 subculture开始做selection---P1
: 4days later, P1细胞confluent，开始subculture 到P2，split ratio 分别是1:10, 1
: :30, 1:100, 1:300
: 10 days later, P2的1:10细胞也confluent，1:300细胞可以看到single colony，但是
: 比较密集不容易pick up。
: 我现在能不能用P2的1:10细胞再做一次1:100的subculture，等几天后看到比较分散的
: colony后再做pick up? 这样是否相当于从P1开始1:1000 subculture？
: 但是另一个博后不赞同这样做，说这3周之中细胞已经transformed的很多，现在再做
: subculture能拿到成功克隆的几率要比P1开始1：1000 subculture要小得多。请问大家
| g*********5
发帖数: 2533 | 4 pcdna3.1 应该用g418吧...
【在 s*********r 的大作中提到】
: 我最近刚做的stable cell line , 用的是pCDNA3.1 载体
: 用的是zeocin筛选，不用G418.开始时候我自己用G418筛选， 老板告诉我是错的，要用
: Zeocin筛选。
: 我尝试过转染293和293HK。
: 转染是regular钙转。 细胞密度是60%。转染后6小时就加药（也尝试过12小时）
: zeoxin浓度是400ng/ml
: 基本上等conflent后，大概3-4天，1：2到2个100mm dish，5天后很多细胞死了，此时
: 转移到60mm dish，等single coloney . 然后等2周 ，看到很多coloney长出来， 然后
: pick up到48-wells .
:
| w********r
发帖数: 1431 | 5 听你的意思是要收mix population,而不是single colony
我的经验是，这种混起来的stable cell通常表达很差，
最好挑好多单个的克隆，然后选几个表达高的，然后每次实验的时候两三个Stable
line 一起用。
我们的策略是在24孔板里做transfection,然后分到6cm开始加药杀，再把细胞分到若干
10cm的盘子里继续杀，关键是密度不能高，要保证最后可以挑到单克隆。调出来的单克
隆放到24孔板里慢慢养，同时做WB检测表达。表达好的就留下，表达不好的就扔掉。
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【在 s*****a 的大作中提到】
: 用的是pcDNA3，HEK293和600ng/ul G418
: Transfection48小时后1:10 subculture开始做selection---P1
: 4days later, P1细胞confluent，开始subculture 到P2，split ratio 分别是1:10, 1
: :30, 1:100, 1:300
: 10 days later, P2的1:10细胞也confluent，1:300细胞可以看到single colony，但是
: 比较密集不容易pick up。
: 我现在能不能用P2的1:10细胞再做一次1:100的subculture，等几天后看到比较分散的
: colony后再做pick up? 这样是否相当于从P1开始1:1000 subculture？
: 但是另一个博后不赞同这样做，说这3周之中细胞已经transformed的很多，现在再做
: subculture能拿到成功克隆的几率要比P1开始1：1000 subculture要小得多。请问大家
| i***0
发帖数: 160 | 6 转染48h后，转到100 mm plate上，加药，每三天换一次液，一至两周后去掉药，等细
胞长满，分到新的100 mm 板上， 一千，500， 200 个细胞/板， 观察单克隆， 用灭
菌滤纸（3mm直径）占trypsin用灭过菌的镊子夹着在单克隆上一抹，然后把滤纸放入新
鲜培养液中（24孔板），immunostain，WB，来确认单克隆的表达量和表达均一性。 | n********k
发帖数: 2818 | 7 well,it is a problem-solving issue: there are always many choices and I
would think it over and over like with any complex experimentations: what
are the options and what might be a best one to approach this...As far as I
am thinking, the less passaging the better...otherwise one might be running
a risk of picking the cells from a same clone multiple times; as well, the
clonal growth/death bias over the passaging could also dramatically change
the properties of the culture over time...numerous potential caveats with
going clonal..
anyway, here how I did ys ago:
Pre-experiments: determine the correct killing dose for G418---vary
dramatically for different cells, for ours, typically 500u for selection (
about 1-2weeks) and 200u for maintenance
1. linearized the plasmids, one could even cut all the vector backbone out
by now..
2. Transfection for about 24-36/48hrs,
3. passaging the cells either to 96 cells plates(harder to control) or
better: to several 10-cm plates at a series of dilution, duplicates for
each dilution...
4. ON and then switch to G418 medium
5. change medium as needed and wait about 1-2weeks and choose the right
dilution plates with optional density to pick the clones...
6. When pick the clones, make duplicates of plates for each clone; one would
be used for preliminary screening while the other to keep going
It is a lot work but this way, within a month, one should be able to obtain
enough clones while finishing up a preliminary screening...after that,
randomly choose about 5-15 clones to perform a first round of careful/
detailed analysis; then choose 2-3 representative line for all following
analysis...
BTW, if i ever have a choice, I would bypass clonal stuff...too much work
and too many caveats: some could be controlled while the rest might or might
not be....
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【在 s*****a 的大作中提到】
: 用的是pcDNA3，HEK293和600ng/ul G418
: Transfection48小时后1:10 subculture开始做selection---P1
: 4days later, P1细胞confluent，开始subculture 到P2，split ratio 分别是1:10, 1
: :30, 1:100, 1:300
: 10 days later, P2的1:10细胞也confluent，1:300细胞可以看到single colony，但是
: 比较密集不容易pick up。
: 我现在能不能用P2的1:10细胞再做一次1:100的subculture，等几天后看到比较分散的
: colony后再做pick up? 这样是否相当于从P1开始1:1000 subculture？
: 但是另一个博后不赞同这样做，说这3周之中细胞已经transformed的很多，现在再做
: subculture能拿到成功克隆的几率要比P1开始1：1000 subculture要小得多。请问大家
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