n**8
发帖数: 221 | 1 请教有转染过 C2C12 和 10T 1/2 的大侠，一般分别什么转染试剂适用于这两种细胞？
不甚感激！ |
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L**********O
发帖数: 1761 | 2 I haven't used these two cell lines, but I feel lipofectamine may work |
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o*****r
发帖数: 156 | 3 Mirus LT-1 works really well, high efficiency (similar to lipofectamine/
lipofectamine 2000), less toxic.
I don't like the PolyFect from Qiagen. |
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n**8
发帖数: 221 | 4 谢谢回复！
oranger大侠用Mirus LT-1转过C2C12？效果如何？ |
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o*****r
发帖数: 156 | 5 I didn't work on C2C12 before, so I don't know about this particular cell
line.
My suggestion is to try both LT-1 and lipofectamine. |
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d******u
发帖数: 178 | 6 非要transfection的话，DreamFect，但毒性比较高。比前面列的效率都高。
Lenti和Retro都可以，如果有selection的话不用太担心效率。Lenti在我手上一直work
很好呀，连照过的feeder cell都转得进去。 |
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n******2
发帖数: 971 | 7 I have the exact same question as LZ asked. Why can't we just use shRNA to
do transient transfection to knock down a gene? Once the shRNA constructs
get into cells, small hairpin RNA will be transcripted, which will be
further chopped by Dicer into siRNA. Thereafter, shRNA shares the same
mechanism for knocking down certain gene as siRNA does. What's the reason
to make stable transgenic cell line? |
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m*********7
发帖数: 5207 | 8 For question #3: the purpose of cloning shRNA into lentiviral vector is to
produce virus particles, and in principle, every single target cell can be
infected. If you use shRNA plasmid directly, you can hardly get 100%
transfection efficiency. |
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a****k
发帖数: 1130 | 9 transfection of shRNA will induce interferon response |
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m******5
发帖数: 1383 | 10 I found some claimed to be 'Chip qualified' antibody naturally gave out
super strong background (when using non transfected or knock out cell line
as negative control), maybe due to non specific binding to DNA or Histon?
I start to wonder if those paper simply use IgG as negative control
really got validated result. |
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S******e
发帖数: 393 | 11 我常做200kD以上的western, 用6%的胶，
做transient transfection 试试看。
当然有一蛋白做瞬转检测不到表达，但stable cell line却筛选到了。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 12 需要某蛋白激酶在我培养的细胞里过量表达，筛选plasmid constructs时测序是正确的
，不过大量培养后得到很多的DNA拿去测序，好像说质量不好，测序结果就没有太较真。
然后就transfect我培养的细胞，取得cell lysate做western blot，发现蛋白表达量对
照vector的control基本无变化。以前我也在相同的细胞里overexpress过一个蛋白，
work得都还好。我应该怎么做，才能用western blot看到蛋白表达量的变化呢？谢谢！ |
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S******e
发帖数: 393 | 13 当时我转的蛋白较大，检测tag可以看到表达，但用蛋白本身抗体检测就看不大出来差
异，说明表达量还不够高。
MCS后一般有stop condon, 所以你的stop condon 没测出来应该没大问题。
我做transfection的质粒一般A260/280 是大于等于1.9， Qiagen kit prep.
plasmid浓度最好1ug/ul 以上。
我觉得你看不到差异的原因很可能是表达量还不够，但你没有tag也没法检测它是否已
表达，你把效率提上去再检测看看，我觉得还是很有希望。
提高转化效率也是我一直的问题，但我估计我转的质粒比你大，我前几天在这问过这个
问题。 你先用脂质体方法试两次，LTX或lip2000, 若还不行，建议你再try电转，据说
效率高出很多。 |
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K*o
发帖数: 96 | 14 有可能是降解太快了，你下次做Transfection的时候，多做一个孔，然后在收细胞前6
个小时加MG132。看看如果抑制降解这个蛋白是不是就能在Western上看到了。
我自己就曾经遇到一摸一样的问题，troubleshooting这个那个的，白费了我好大功夫
。 |
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z********i
发帖数: 610 | 15 我们主要是做细胞方面的东西，reporter assay也做的比较多，经常会遇到你说的这种
情况，我个人觉得是transfection的影响，就是用空质粒补平了，也会出现。有这种情
况，在转染试剂一定量得情况下，共转两个质粒，一个质粒单转+空载体补平，你会发
现共转的表达强。
所以需要用其它的质粒去normalize。一般这种实验不是主要data，重复几次结果一致
就可以了。 |
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S****r
发帖数: 982 | 16 Then, how could it be explained that dsRNA analogy in culture medium
activates TLR3, while transfected dsRNA analogy activates RIG-1/MDA5?
Thanks in advance!
at
production. |
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L****S
发帖数: 89 | 17 Great question! I think it may be all about location. And transfection
reagents alter the distribution of ligands to different subcellular
locations.
For TLR4, it's surface vs. endosome.
For dsRNA, it's endosome vs. cytosolic.
Maybe a cell biologist can tell us how liposome tranfection works? |
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S****r
发帖数: 982 | 18 We performed a reporter assay on RAW cells days ago. The transfection
efficiency is fine, around 10-15% with EGFP. However, luciferase value is
extremely low, including both Firefly and Renilla that acts as the internal
control. I wonder if an activation is required for these cells, just like
handling in T cells that requires PMA and Ionomycin?
If it requires, what's concentration should I use?
Thanks in advance!
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a******g
发帖数: 129 | 19 That definitely helps. However, given such a low transfection efficiency, I
personally don't trust those luc data although many paper showed nice
results from this assay. |
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y**u
发帖数: 7459 | 21 嗯，没说清楚, 是mouse pancreatic beta cells, insulin-secreting, 不是spleen那
个。 |
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f***k
发帖数: 143 | 23 它会感染人的细胞,但是它没有复制的能力,所以也就是个transfection而已~~不用太擔心 |
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s******r
发帖数: 2876 | 24 有没有形态比较好的表皮细胞，同时又容易transfect的，
293细胞质太少，不太好观察蛋白荧光定位。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 25 No. You misunderstood the paper. ATP is used to activate the adenosine
receptor.
The largest calcium store inside the cell is endoplasmic reticulum, which
can release a large amount of calcium upon IP3-R is activated.
Mitochondria is critical in maintaining calcium homeostasis and will take up
calcium if there is calcium overload.
You can transfect your MEFs with cytoplasmic aequorin (you can search on
this to get a better idea), which is widely used as a intracellular calcium
indicator.
You can... 阅读全帖 |
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s******n
发帖数: 47 | 26 感谢回复！
请问是用在什么细胞系
是不是用santa cruz的那个附带transfection reagent/medium转的呢？
不甚感激！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 transfection reagent 啊？无所谓的，各个公司的都差不多 |
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o*****r
发帖数: 156 | 28 1. try to mix two plasmid at the very beginning, before lipofectamine;
2. try a different transfection reagent. |
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F*******2
发帖数: 103 | 29 This happens a lot, first make sure your cell isin a healthy condition then
change to another transfection reagent |
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W**S
发帖数: 275 | 30 今天悲摧了，generate了一批LENTIVIRUS，结果PURO SELECT之后CELL都死了，这次着
急，没做MIDI PREP，直接用MINIPREP的PLASMID做的TRANSFECTION, PLASMID的质量不
是太好，浓度很低，260/230不太好，同一批用MIDIPREP GENERATE的VIRUS没问题。请
问LENTIVIRUS不WORK会是因为PLASMID的质量不好吗？以前也用MINIPREP的PLASMID做过
，没问题。多谢！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 33 拷贝完整地址，可以打开没问题
或者你google文档标题，源文件来自roche |
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b**********8
发帖数: 349 | 34
Many thanks.
Could you pls give more detailed information about BAC and stable
transfection? Or any literature would help me greatly. |
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c******r
发帖数: 3778 | 35 这个marker其实不难搞，就是transfect一个HIF promoter drive的东西就可以了。
不过你要真做的话要小心几个问题：
1. hypoxia在实体肿瘤里面是永远存在的。即使你不喀嚓那些血管也一样有marker的表
达。因此你的background会比较高。
2. 即使喀嚓掉血管，如果不能有效抑制VEGF等signal，血管会很快又长出来的，而且
会越来越多，越喀嚓越多，导致你无法实现有意义的hypoxia。
3. 因此，喀嚓血管可能需要和VEGF inhibitor啥的联合使用。可以看情况再考虑这个
问题。
4. 你的control tumor也需要相似的剥离，但是不结扎血管。因为显然剥离的创伤有可
能破坏tumor的包膜而导致扩散，与hypoxia无关。
5. 你的种植的tumor一定要有很高的metastasis比例才行，否则后续试验无法进行。这
种cell line可以去找找，有人有这样的cell lines。
仅供参考 |
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j*****d
发帖数: 787 | 36 http://the-scientist.com/2011/09/20/plant-rnas-found-in-mammals
+Plant RNAs Found in Mammals
MicroRNAs from plants accumulate in mammalian blood and tissues, where they
can regulate gene expression.
By Cristina Luiggi | September 20, 2011
11 Comments Link thisStumbleTweet thisDreamstime.com, Rewat
WannasukMicroRNAs from common plant crops such as rice and cabbage can be
found in the blood and tissues of humans and other plant-eating mammals,
according to a study published today in Cell Research.... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 37 can I use miniprep plasmid do transfectIon?
thanks. |
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s********s
发帖数: 67 | 38 transfectIon rate is usually low in neuron .Try virus if you have. |
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f*******e
发帖数: 354 | 39 做了个flag-tag fusion protein，在293 transient transfection, 用蛋白本身的抗
体检测是一大坨，q-pcr 表达也是有几十倍的升高。
但是就是用M2 beads IP不下来或者极少。
然后用flag 抗体检测，居然多次检测不到。最后是在疯狂一下地翻了10倍的二抗量 膜
都要压爆了才压出来条带正确的带，大小正确，量也与基因本身的抗体显示的量对应。
这在本实验室在293瞬转检测中似乎从来没有遇到过。
难道是flag跟我的蛋白在一起就难以检测？ 甚至在denature gel中？
那在nature状态下更难结合？所以IP失败？
求教，
非常感谢 |
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f******l
发帖数: 101 | 40 借用老公的ID。
怀孕了，但是实验要用到adenovirus做transfection。开始觉得规范操作，应该没有什
么问题。
但是昨天忽然梦见别人为了腾地方，把我的留在incubator里的好些96孔板竖起来放了
，液体流的到处都是。我都给吓醒了。当然，现实中，不会有这么傻的人啦。
然后想到，万一自己不小心打翻了一个plate在地上，会不会有什么危险呢？打算去学
校safety问问，可是他们好像只管规范操作，但是对生物没什么了解，可能没什么合适
的建议。
大家对adenovirus比较熟悉的能不能给点建议呢？这是我第一次接触。 |
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f******l
发帖数: 101 | 41 我以前自己的project也是用电转做stable cell line的。
但是现在最主要是工作以后protocol不由自己选择了，二是现在是transient，电转死
的细胞太多，而普通的transfection reagent效率又太低。 |
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L*****o
发帖数: 48 | 42 从转基因小鼠里提取了一些primary cell，准备做一些细胞实验。想请问一下，可以直
接加soluble Cre敲除带有lox-P的细胞吗？还是应该用adeno-cre transfect?多谢！ |
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s********s
发帖数: 67 | 43 弄个表达cre的质粒transfection 就行 |
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b**********8
发帖数: 349 | 44 最近要做一个inducible shRNA 的stable transfection，采用的细胞株之前已经做过
一遍稳转，G418 resistance。现在改用Hygromycin B筛选新的稳转株，已经挑了将近
100个克隆了，一个阳性的都没有挑到，很郁闷。想问下有经验的战友们，已经做过一
轮稳转的细胞株，再做新的稳转，是不是难度特别大？什么原因呢？难道是我人品太差
？ |
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f*********8
发帖数: 129 | 45 谢谢。
我做的是U2OS,刚transfect了一星期，还不知道怎样。如果有多一点的resistant
clones那还好。后面会用western鉴定。就怕最后一个都没有，又要重来。 |
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e***o
发帖数: 344 | 46 HEK293T expresses SV40 large T antigen, amplifying transfected circular
plasmids harboring SV40 replication origin. |
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v*********d
发帖数: 382 | 47 要高效肯定是病毒，效率就看titer了，高titer下，90％ 没问题
要是50％－70％ 左右可以的话，可以试试lonza （Amaxa）或者invitrogen 的 neon
transfection system， 都是电＋化学的。 另外，MEF passage越多，效率越差 |
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v*********d
发帖数: 382 | 48 要高效肯定是病毒，效率就看titer了，高titer下，90％ 没问题
要是50％－70％ 左右可以的话，可以试试lonza （Amaxa）或者invitrogen 的 neon
transfection system， 都是电＋化学的。 另外，MEF passage越多，效率越差 |
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p*******l
发帖数: 24 | 49 哪位有经验的说说，
该种多少细胞 （我用U2OS）？
是不是很难把细胞在chamber里均匀铺开（面积小）？
多谢指教。 |
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l******i
发帖数: 17 | 50 Look in Invitrogen Lipo2000, there is recommended number for cells needed.
Roughly it equals to the area of 24-well plate. |
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