v***a
发帖数: 1242 | 1 我在研究某个蛋白在其overexpress情况下对某个器官的作用。想给老鼠注射含有这个
蛋白insert的plasmid DNA，第一次做，不知道有些什么需要注意的？是不是可以用PBS
作为等价于in vitro中溶解DNA的buffer/media？我在in vitro中overexpress的时候，
用的transfection reagent是QIAGEN的effectene，不知道给老鼠注射的话也仍旧可以
用这个吗？或者大家有推荐的吗？
非常感谢！ |
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m*********7
发帖数: 5207 | 2 不需要用lipid based transfection reagent。 |
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R*****w
发帖数: 447 | 3 直接注射是可以的，只是转化效率很低。至少肌肉注射ＤＮＡ可以表达目的基因、刺激
机体产生抗体，但要多次大量注射才行（50ug/20gmouse/dose,３－４次）
in vivo 用transfection reagent 效果不明显 |
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J*******6
发帖数: 72 | 4 有国内的药厂要我在美国为他们卖G418, aka Geneticin, 纯度达》98%。it is used
to select transfected stable clone in cells.
一般哪里会要？如有需求， 能回扣。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 5 个人建议哈。这个Amaxa最好还是先做个test。找个GFP plasmid，用他们提供的那个也
可以，然后买个test kit，里面有两个还是三个不同的buffers，然后按照他们的
manual各种情况都做一下。然后flow，这样可以有个比较准确的了解trasfection
efficiency。flow的时候可以加上PI，这样可以了解viability。
这样可以选个比较好的protocol。
如果选好了，这个Amaxa的效率是非常高的。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 7 最好先过一两天让细胞缓一缓--done 1day or 2 days
抗生素浓度 titration--done |
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e***o
发帖数: 344 | 8 我需要transfect一些barcode，然后是用来测single barcode序列的。老伴没做过
bench work，天天说能检测到一个copy。不知道有没有法稳定到10copy去。你检测到10
个copy的PCR条件是什么. |
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s***o
发帖数: 1189 | 9
up
I second this and would highly suggest you find another lab.
The atmosphere in this group is not healthy. And problem like this generally
seeds from lacking proper managerial skills of the top, meaning: you can do
nothing and may only take heat. As a rotation student you have a long way
to go to get to the PhD level and during this process you need lots of
SINCERE help from your colleagues, which i just don't see it happen in this
group.
You are blaming yourself too much. If you are certain... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 10 不确定就分开三个试试好了，混一起有几个问题：
1. 增加了off target的机会。
2. 发paper的时候，如果是critical experiment还是需要证明单独的siRNA起效。
3. 混一起，如果virus的效率很高也就罢了。如果效率比较差，那么会有很多cell只感
染一个，两个的。你最后的phenotype就会比较moderate，以后的实验就比较麻烦。
这个跟pool的siRNA transfection一样。如果只是一个比如说pilot experiment，其实
倒是无所谓，混着就混着用好了。 |
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H*****e
发帖数: 120 | 11 Also asking:
Can 293T cells stably infected by one retro- or lenti-virus produce virus if
transfected with the packing system again? |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 Oh...I thought it was accidentally made with antigen T by virus infection or
something. Guess I was wrong.
So it was intentionally made by stable transfection? |
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O******e
发帖数: 4845 | 13 Transfection难度还是比较大。如果不介意的话，用病毒效率会高很多。 |
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f*****Y
发帖数: 20 | 14 Using Lipofectamine 2000, over 80% of mouse ES cells can be transfected |
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r******m
发帖数: 10 | 15 在一个生物物理实验室， 要用lentivirus transfect neurons。实验室以前也没有别
人做过。
看看biosafety的描述，很危险的样子。
问一下有经验的同学，用lentivirus是不是真的很危险，要注意些什么？ |
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r******m
发帖数: 10 | 16 Thank you!
那用lentivirus transfect 过的细胞的培养液危险吗？Image细胞的时候有时候会洒到
外面又不知道。 |
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h***a
发帖数: 145 | 17 what's the advantage of studying the role of a protein by transfecting
cells with this protein over studying naturally expressed proteins in
certain cells?
Thanks |
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m***e
发帖数: 16 | 18 想在神经细胞中表达一个蛋白，想制作一个stable cell line。
但是发现神经细胞都是原代培养的，
故想请教有什么neural cell line能持续分裂，并且可以用来做transient
transfection和
stable cell line呢？谢谢 |
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p******i
发帖数: 1092 | 19 我猜在related products里面吧……
你去addgene买个3XFLAG的CMV promoter的plasmid，最好蛋白size也和你做的差不多，
自己做transfection…… |
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a*****y
发帖数: 269 | 20 【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: alvinpy (生命就是一场歪打正着), 信区: SanDiego
标 题: Post-Doc Positions at Pfizer
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 16 20:10:46 2010, 美东)
Please send in cover letter and CV to Nathan Lee: n**********[email protected]
Postdoctoral Positions in Pfizer Oncology, La Jolla CA
The post doctoral positions will be responsible for elucidating the
mechanism of action of existing Pfizer
portfolio compounds, ensuring that we have the appropriate patient selection
strategies for such
mechanisms, aligning ... 阅读全帖 |
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a****k
发帖数: 1130 | 21 你的100pMol是到多少ml的medium里面呢，终浓度是多少？我最近在一个基因上面试过
从0.8nM到10nM，一天就都可以看到很好的knock down了。不知道你是transfect之后几
天看的，有些long-lived protein还是要多等等，先让已经表达的蛋白降解掉
nM |
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O******e
发帖数: 4845 | 22 It is just too hard to get good transfection. |
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l*****m
发帖数: 122 | 23 谢谢你的建议:)
具体说说我的virus载体和transduction的过程吧~
1> retrovirus用的是MSCV based带有mir155 backbone的一个载体（某postdoc自己构
建的）有GFP marker。因为它只侵染dividing cell, 所以就在collect BM的当天做一
次spin infection （用fresh virus containing sup from transfected 293T cells)
，之后两天各做一次spin infection，然后让细胞在有GMCSF的medium里面继续分化到
day7 (中间换一次medium). 最后收细胞染色FACS. 现在结果就是no virus control分
化没什么问题，通常我得到90％ CD11c+细胞，其中MHCII+大概15％；问题是无论是
control virus (empty vector)还是有target shRNA的virus，细胞就不表达CD11c了 (
<10%），MHCII到没怎么变，还看过CD86之类的co-stimulatory molecul... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 4361 | 24 RXi那个东西貌似原理没公开，俺们lab有人在细胞系里用过，说是效果跟用liposome t
ransfection差不多，但是不需要transfect reagent。
但是it的siRNA并没有overcome delivery的问题，直接iv injection，还是会降解，我
看也没多大进步。 |
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b*********8
发帖数: 116 | 25 如果只能用transfection的话，哪位做过用lipofecamine的？或者只能用electro
多谢！！ |
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E*****e
发帖数: 54 | 26 paper上说的不是太详细，只是说screen with a siRNA library targeting 21000
human
genes. 请问这个具体怎么操作的？ 这个library拿到手是2万多个管子吗？然后一个个
的做transfection？
这个工作量太大了吧？ |
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z****g
发帖数: 3340 | 27 一般是micoplate version and reverse transfection.普通实验室在现在这个大环境
下恐怕完不起,并且后期N多data处理也不是普通实验室能干的活. |
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a****d
发帖数: 1919 | 28 u can transfect as many as u can. |
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S****r
发帖数: 982 | 29 try try RNAiMax from invitrogen |
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d********e
发帖数: 8 | 30 I called their tech support once concerning the same question. They told me
the amount of Darmafect to be used should be fixed for the same number of
cells.
uL |
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d******e
发帖数: 351 | 31 试了两次，真是油盐不进啊，转化效率约等于零。
各位高人有好用的PROTOCOL吗？ |
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A******y
发帖数: 2041 | 33 virus...using chemical agents for primary cells and lymphocytes don't expect
much. Now you know why big pharmas are dropping RNAi division. |
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w********r
发帖数: 1431 | 35 你的primary myocyte是说satellite cell么？
如果是的话，我用lipoRNAiMax往primary myoblast里转过siRNA，效率还可以，我做
western看过。
转plasmid确实是进不去，我都是用Adenovirus。
不过看业内大牛的paper也有往里面裸转质粒的，具体用的啥试剂记不清楚了，你可以
去查查Michael Rudnicki的paper. |
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p******i
发帖数: 1092 | 37 我把TLR4 cDNA (2.6kb)从macrophage里PCR出来，加上XhoI和BamHI，接到
pEGFP-N1里，测序结果也是正确的，就是TLR4后面接了个in frame fusion的EGFP
但问题是transfect到293T里不亮，而空载体pEGFP-N1很亮……
我现在怀疑是kozak不够强，准备在ATG前面加一个
GCCACCATGGXX，不知道会不会有帮助……
哪位做过类似的实验，请不吝赐教啊，
在下先谢过了…… |
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p****z
发帖数: 31 | 38 最近很是郁闷，做啥都不顺！又碰上一问题，向大家请教。有一个和癌症相关的蛋白，
它的功能最近被发现能促进cell proliferation，这一现象被好几个group报到了并且
在不同的肿瘤细胞中都是相同的作用。他们用的方法都是使用siRNA knock-down这个基
因，然后用MTT assay 或者是thymidine incoporation assay去测cell proliferation
.我为了方便，就用了lentivirus (pLKO.1 based vector, open biosystem)做了
stable cell line,试了两个细胞系，knock-down 效果都不错，从western 上来看，
估计有80%-90%的reduction. 可是一测cell proliferation ,cell proliferation的抑
制效果都不明显，我用了两种方法：promega的MTS assay 和 BrdU incoporation
assay.这到底是怎么回事啊？我看了他们做的方法，最大的差别就是他们是transient
transfection... 阅读全帖 |
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S**********e
发帖数: 1789 | 39 我自己也还在干活，养了一大堆细胞等着做knockdown。我总是遇到一个问题，当我准
备transfect 293 细胞的时候，他们都一片一片的掉下来了， 这样plasmid还能进去吗
？大家怎么解决这个问题的。
Happy Holiday! |
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n********k
发帖数: 2818 | 40 with non-coated plates, unless very experienced and careful, never change
medium right before the
transfection, the cells will cluster and decrease efficiency...could change
the medium 6-12 hrs before hand... |
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c***y
发帖数: 615 | 41 转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
pGL4.74, HSV-TK-Renilla
control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
24-3'DNA 和 pCMV
结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luc... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 42 一直用罗氏的FuGene HD，非常好用，貌似他们现在还有更新的产品。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 44 borrow a GFP expression plasmid from any nearby lab. |
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B******o
发帖数: 496 | 45 你问题里提到的24小时候之看到很少的细胞是GFP+。 这是infected的吧？
infected cells need at least 2 days to express the transgenes. 如果你仅仅在
24小时后就去check GFP，很难看到positive的细胞。应该多留一下，过一天再看，才
能知道你的virus titer到底如何。
如果2-3天后，infected的细胞里GFP+的还很少。那么说明你virus titer很低。这时候
你得去查是不是transfection效率不够，如果不是，那么说明你的packaging plasmid
或者packaging cells不好。 |
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j********r
发帖数: 156 | 46 Is there any disadvantage of using siRNA transfection for some functional
assay, such as cell viability or cell death? Can anyone recommend a vendor
for
synthesize dsRNA (if the target sequence is already known for efficient
knockdown, based on the use of shRNA)? Many thanks,
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j********r
发帖数: 156 | 47 Thanks. So if I get very quick phenotypes in cultured cells using siRNA
transfection, will the data be convincing? Do I still need stable shRNA (
regular of conditionally if it is lethal) to confirm the results?
It seems there are also disadvantages of shRNA, such as in some cases
sequence-specific toxicity (probably due to overloading the RNAi machineary)
. But I am not sure about the down side of using siRNA. |
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f**g
发帖数: 28 | 48 Hi everyone,
I made some stably transfected cell lines with 293 cells. One cell line is
difficult to freeze down. Most cells were dead after frozen with 10% DMSO
in serum. Other cell lines are pretty normal. So anyone can give
suggestion on this problem?
Many thanks in advance. |
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f**g
发帖数: 28 | 49 I transfected different oncogenes into 293 cells. I'm wondering whether
some oncogenes may affect cells and make them sensitive to freeze down. If
so, there must be some factors changed by the oncogene. Then this should a
part of function of oncogene.
What are factors associated with cell freezing? |
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d**********2
发帖数: 103 | 50 谢谢大虾～请问你指是GFP transfect的细胞死过头还是STS处理的细胞死过头了？STS
那个我是按protocol的。。。 |
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