D****g
发帖数: 275 | 1 You can try electropotration to increase the transfection efficiency, such
as the neon system from Invitrogen or Nucleofector from Amaxa, you can
easily transfect the cells for more than 40-50%.
internal |
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S*****s
发帖数: 287 | 2 不用担心，都是一样的东西。本来是 Roche 卖的，马上专利要到期，所以 Roche 不卖
了，换成了更新的 XtremeGene 9。我们实验室用 Fugene6 很多，每次买都是 25 瓶一
起买，然后拿一个 volume discount。所以 Roche 的 sales 专门到我们实验室来做过
Seminar 介绍这个新产品，希望我们也换过去。最近我们发现 Roche 不卖了 Promega
反倒开始卖了，所以也不担心没得用了。XtremeGene 的效率比 Fugene 高。如果你以
前没用过 Fugene 的话建议从 XtremeGene 开始用，要是一直用 Fugene 的话建议不要
贸然用 XtremeGene，transfection efficiency 和 maximum transfection 都不一样
。 |
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C****b
发帖数: 90 | 3 We have a RNAi screener who spent around 3 months to optimize the MEF
transfection condition. Finally she got 70~80% transfection efficiency.
Summary
Reagent: DharmaFECT
Cell: 30% confluent MEF instead of 70~80% confluent
Good luck! |
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C****b
发帖数: 90 | 4 We have a RNAi screener who spent around 3 months to optimize the MEF
transfection condition. Finally she got 70~80% transfection efficiency.
Summary
Reagent: DharmaFECT
Cell: 30% confluent MEF instead of 70~80% confluent
Good luck! |
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B******o
发帖数: 496 | 5 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。 |
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n****n
发帖数: 434 | 6 there are too many answers to the problem:
1. cell types (find a higher expression cell type or line)
2. antibody quality (antibody are NOT universal, being good for western does
not mean good for IP. if the antibody was never tested for IP, you can try
dilution factor/incubation time. use of transfected lane as control will
help [can you IP your transfected target using both your antibody and anti-
TAG?]. try different antibody from different source)
3. your IP skills (by no means i look down a... 阅读全帖 |
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m**********d
发帖数: 137 | 7 in vitro用luciferase标记肿瘤细胞，打入体内，用bioluminescence和PET/CT跟踪肿
瘤生长和转移
有个很基本的问题没搞明白，我查看实验室前人的notebook发现他当年用transient
transfection转染了一个表达luciferase的plasmid进去，用puromycin筛选一段时间，
就打进老鼠里去了，我在想他为啥不用lentivirus来做stable cell，像他那样做的
transient transfection随着肿瘤细胞的不断分裂岂不是早被dilute了，就算在in
vitro一直有puromycin的selection pressure，那达到体内之后呢？总之觉得不大靠谱
，可那位前辈已经离开了lab，所以来这里请教请教
多谢 |
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n********k
发帖数: 2818 | 8 Thanks...But I am not sure that;s trustable or not...we have been using the
Amax for ys, and it works nicely...however, it is pretty expensive and I am
debating whether I shall switch to Neon for my future lab...THus, I would love to see
some first-hand experience...
Culture/Transfection/Transfection___Selection-Misc/Neon-Transfection-System/neon-vs_-amaxa.html |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 这个已经试过了，没有用，因为那个质粒上是个Kan/Neo selection marker,
太tmd的没用了。因为必须至少选5天才能选出东西来，首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
而且stably integration 本身就是一个非常低概率的事情，如果一开始的transient transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
对于puromycin 这种比较凶狠的药说不定还能选出来，但是我们的那个蛋白
是在别人实验室里拿到的，里面就只有Kan/Neo |
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m******5
发帖数: 1383 | 10 什么细胞啊？ neo很猛的啊,为什么用kan
首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都
因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的
vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细
胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 11 TRY INSERT PURO CASSET BEFORE THE Neo/kan?
600bp with GBLOCK FROM IDT.
transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 12 sunny, could you try to replace the Kan/Neo with puromycin
with Gibson fragment?
transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 RE:
孵蛋的 学弟/妹 giantbird05
温故下
http://www.mitbbs.com/article_t1/Biology/31657283_0_1.html
2nd floor
就知道新的
//www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell
-Culture/Transfection/Transfection___Selection-Misc/Neon-Transfection-System
/Neon-Protocols-Cell-Line-Data.html
这一答案啦
发信人: giantbird05 (大鸟), 信区: Biology
标 题: Re: 用什么办法能提高fibroblast 和MEF转染效率呢，
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jun 27 14:34:56 2012, 美东)
can you give me a neon protocol about these kind cells?
thanks.
30% |
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a****d
发帖数: 1919 | 14 it should work for flow
make sure you have no-transfected control population
do several different transfection dose may also help to tell the difference |
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k********u
发帖数: 7 | 15 I used pcDNA3.1-gene for overexpression transfection. If I wanna perform
flow cytometry analysis, shall I use transcient transfectants or stable
clones after selection for 2 weeks??? Thank you very much... |
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b****r
发帖数: 17995 | 16 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
的binding 能力）。
我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？ |
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f*c
发帖数: 2726 | 17 说实话，我真是想骂她，日本人，有时候我真觉得这人有毛病，要么就是更年期。
有一次某样试剂用的很快，她就一直怀疑是新来的薄厚把它洒了。还有一次，我用完离
心机后她用，她觉得有问题，我觉得没问题，她不放心，叫人来检查，检查的人说没问
题，然后她接着用，结果短路了，来检查的人大概把线路接错了，她说她很伤心。我特
幸灾乐祸。
要说，她也是senior scientist了，发了不少cell, 最近做 plasmid transfection to
293T,一直没成功，然后怀疑我给她的细胞有问题，我说没问题，因为我transfection
没问题，后来说她没有在转染前一天传细胞，她把细胞传得很稀，然后等到2-3天后细
胞多起来，再转。我觉得这也算是低级错误了。 |
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a******a
发帖数: 283 | 18 ask a question in this thread: regarding genomic DNA purification. I will be
doing about the same project -- qPCR genomic DNA for the amount of gene
inserts after transfecting the cells with retroviral vectors.
My plan is to transfect the cell culture on day 1; then on day3, harvest
cells and collect genomic DNA. at this point, how to eliminate the plasmids
present in the cells (if there is still any left without incorporating in
the genome)? would centrifugation alone enough to get rid of most ... 阅读全帖 |
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a*****n
发帖数: 2835 | 19 you can also use regular 293t if you feel hard to handle 293ft
I usually use 293t for profucing lentiviruses. I do not change medium before
transfection but change medium 24hours after transfection. |
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s****9
发帖数: 932 | 20 我刚才吃饱了撑着pubmed了一下“NTCP and HepG2”，HepG2确实不表达NTCP。为了用
HepG2研究NTCP，都需要做stable transfection。
看这段：
“Human hepatoblastoma cells (HepG2), cells that have lost native Ntcp
expression, were stably transfected with the rat Ntcp gene.”
PMID: 14598021。
不知道你们实验室是不是做HBV的，还是刚刚半路出家。
HBV |
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d********r
发帖数: 211 | 21 还是这篇文章, 他们怎么把successfully transfected cells 和 non-transfected
cells 分开的啊? |
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v***a
发帖数: 1242 | 22 最近一直做siRNA transfection做不出，找不出问题在哪。想换一个转染试剂。
没有用过主流的Lipofectamine系列，不知道哪一款比较适合primary mammalian Cells？
还看到Mirus Bio 的 TransIT-X2 广告，说“TransIT-X2 is an innovative non-
liposomal, polymeric system that has better transfection performance than
Lipofectamine 2000”，不知是真是假？
恳请高手推荐个好用的。 |
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j******i
发帖数: 939 | 23 transfection 50%太低了 应该有100%的啊 你的transfection可能有问题 有普通的gfp
plasmid对照吗 另外 gfp是必须的吗 如果不是必须就去掉吧 或则用2a连接 |
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n********e
发帖数: 1630 | 24 paper多如牛毛 你要的是transient transfection 还是 constitute transfection |
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m*********D
发帖数: 1727 | 25 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
ssDNA在真核细胞内不如dsDNA的plasmid稳定... 阅读全帖 |
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w***r
发帖数: 709 | 26 这个人太牛X了。他在song h 甲基化文章真的很炫!！
但是我个人觉得
Cytochrome P450 drives a HIF-regulated behavioral response to reoxygenation
by C. elegans. Science (2013) Vol. 341 no. 6145 pp. 554-558. PMID: 23811225
这篇文章似乎新意不够，hif 和p450和缺氧的关系早就知道了。下面是一篇，还有不少
有明白人讲一讲吗？
Inhibition of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-stimulated Cyp1a1
promoter activity by hypoxic agents.
Kim JE1, Sheen YY.
Author information
Abstract
Since hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) and the arylhydrocarbon
receptor (AhR) shared th... 阅读全帖 |
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w***r
发帖数: 709 | 27 这个人太牛X了。他在song h 甲基化文章真的很炫!！
但是我个人觉得
Cytochrome P450 drives a HIF-regulated behavioral response to reoxygenation
by C. elegans. Science (2013) Vol. 341 no. 6145 pp. 554-558. PMID: 23811225
这篇文章似乎新意不够，hif 和p450和缺氧的关系早就知道了。下面是一篇，还有不少
有明白人讲一讲吗？
Inhibition of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-stimulated Cyp1a1
promoter activity by hypoxic agents.
Kim JE1, Sheen YY.
Author information
Abstract
Since hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) and the arylhydrocarbon
receptor (AhR) shared th... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 28 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
*... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 29 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
还有约25%在酶切上看不出来，也没有sequenci... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 30 嘿嘿，cas9对我就是生物对新Ph.D.么。：）。
对需要transfection效率需要高的体系，你说的体内可以理解。对少数细胞系因
transfection效率低，不是可以筛选吗？
“一转就是一坨”是只转进去的DNA太多，怕off-target? |
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m*********D
发帖数: 1727 | 31 你是问那个library的availability吧？我也感兴趣。
我倒是觉得genome screening不是大问题。如果一个细胞里进去3-5个guide seq.，三
五个基因knockout,外加off-target,一deep seq,基本就知道了对象。这个思维在没有
好的合适自动化的high-throughput screening的时候，一个样品里加十个compounds,
有了效应在一个一个分析差不多。倒是用这样的library,细胞的转化效率确实要考虑。
不用virus delivery,效率低，会比较麻烦。
mousemice网友说的有些细胞对筛选敏感我自己体会过。我用的deliver方式是有25-50%
的细胞能被transfected。但我筛选后只有大约1%细胞survive。以前和这里一个网友交
流时，他/她用sorting，也是1%。我想很多transfected细胞也许表达量不足，过不料
筛选这关。不知道cas9的表达量和genome edit的效应的平衡点如何，太多会有太多off
-target,太少连自己的target也切不了。估计也是不同细胞不一样。... 阅读全帖 |
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m********2
发帖数: 317 | 32 Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
22.
Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
for the original virus we have been using standard calcium phosphate
transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
vector:psPAX2:pMD2.G.
The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
concentrated 50-100x with ultrazentrifuga... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 33 没有用过Polyethylenimine作transfection，不敢说。
MCF-7--难transfected,一般用Fugene，reporter的活性能检测到。
DU145--还可以。我们一般用lipofectamine 2000.
HepG2--不太好。lipofectamine2000或Ca++-DNA共沉淀的方法都能作，检测reporter基
因问题不大。
最容易的是293T。新大lipofectamine 3000的毒性比较小，你可以看看它的说明，似乎
对很多细都不错。 |
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c***c
发帖数: 113 | 34 I have one postdoctoral position open starting from 9/1/2015 in the
University of Texas Health Science Center at Houston as my lab is moving to
there. We are looking for candidates with strong background of molecular
biology, especially with experience in management of conditional knockout
mice, and lenti/AA-virus transfection in vivo and in vitro. The position
will be supported by a newly-funded R01 grant (2015-2020), which is focused
on regulation of microglial activation in the context of st... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 35 我设计的时候没验证，主要是赶时间。
验证么，就是找一个transfection效率比较高的细胞，这个293显然合适。如果你的细
胞有很高的transfection efficiency,应该更好。理由是不同的细胞系之间会有SNP，
如果运气不好，正好在你的guide sequence之内，那在293验证的结果可能就不完全反
应你的细胞系的效率。
上面是我的理解。这里CRISPR expert多，清指正。我一般设计好guide sequence后，
会PCR一小段我准备用的细胞的genomic cDNA，测序保证没有SNP.上次测了一个2。5KB
片断，有三个SNP,但都不在我的guide sequences之内。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 36 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？ |
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y****m
发帖数: 37 | 37 首先要说明的是此文不针对任何个人，只对science。我真心希望韩的文章可以被重复
，而自己也在试着重复。
对于这片文章，我本人有一下几点疑问，看看那位高人能解答一下：
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个guide也能行，确实比较神奇。当然，
不能够排除NgAgo本身特殊，就是能够切双链，只是从其类似蛋白结构上讲，可能性很
小。
3... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 38 楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个gu... 阅读全帖 |
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y****m
发帖数: 37 | 39
楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
----见上
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 40 对于第三点你没仔细看论文吧？
看了一下论文，作者先转Ago，然后分别在12h和24h转gDNA，fig 2b显示12h无影响，但
是24h load的gDNA明显减少。
作者的解释是NGAgo 装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行，所以如果后转染gDNA可
能导致体内已经成熟的Ago无法结合gDNA，这也解释了为什么体外纯化的Ago蛋白无法在
37C装载gDNA，而只能55C装载，代价是可能导致蛋白部分失活变成一个Nikase。
另外作者在supplemental里面也提到了可以通过再次转染gDNA的方法提高效率。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。 |
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发帖数: 1 | 41 To be honest, the so-called evidence of data manipulation or fabrication in
Han's Paper
is so weak.
So far, two major pieces of evidence have been presented.
The first one is the shape and migration of DNA bands seem not to be similar
to those shown on protein SDS-PAGE. For these IDs, I will suggested a book
of DNA electrophoresis where you can read about some fundamental concepts or
knowledge. The following book are helpful to understand the DNA
electrophoresis data. (DNA Electrophoresis, Edite... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 42 To be honest, the so-called evidence of data manipulation or fabrication in
Han's Paper
is so weak.
So far, two major pieces of evidence have been presented.
The first one is the shape and migration of DNA bands seem not to be
similar
to those shown on protein SDS-PAGE. For these IDs, I will suggested a book
of DNA electrophoresis where you can read about some fundamental concepts
or
knowledge. The following book are helpful to understand the DNA
electrophoresis data. (DNA Electrophoresis, Edite... 阅读全帖 |
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n**********g
发帖数: 196 | 43 It's funny that you just picked the soft accusations to argue against.
Those are not "major concerns", especially PS. PS is intended to explain the
real major concerns, which are
1) lack of reproducibility
2) band shift pattern are conflicting with each other in Fig4a and 4e.
3) the integrated intensity of bands in Fig 4c is not consistent with their
size and molar ratio.
ssODN transfection tricks? No one has issue transfecting it with CAS9.
Take your time and read your book. Then come back with... 阅读全帖 |
|
n**********g
发帖数: 196 | 44 1) I have no comments, but Dr. Chou has mentioned he was able to reproduce
it.
The biggest concern is not addressed by your answer.
2) DNA band and migration are easily alternated by sample ionic strength and
buffer.
No, I did not talk about band distortion. Read my question carefully. Fig 4a
and Fig 4e. No shift when cleavage sites are 30bp and then clear shift when
cleavage sites are closer.
3) Visualization/staining and capture will add non-linear effects to DNA
quantitation. Un-even chemical... 阅读全帖 |
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n**********g
发帖数: 196 | 45 OK, you want basic chemistry and here is basic chemistry.
“Since ssDNA
can not bind to the editing enzyme alone in vitro, the conclusion will be
the enzyme needs the second substance that is a conformation-ready genomic
DNA to form a functional enzyme-ssDNA-genomic target DNA complex to complete
the reaction. ”
----This is so wrong. There could be 100 reasons why an enzyme does not bind
a substance. For example, temperature, pH. Most importantly, it directly
contradicts Han’s data (Fig 1,2).
“As... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 46 我手里用的是韩老师送来的NgAgo DNA (N).
1。 我们设计了CAS9-gRNA plasmid (C) & Podicin promotor-GFP plasmid (P) using
lipo-fectamine 2000 co-transfection into podocyte. Podicin is only
specifically and weakly expressed in podocyte.当然，我们也加了neomycin选择.
按照设计思想，只有Podicin promotor-GFP 正确编辑插入，才可以看见绿色。我们确
实可以看见微弱绿色荧光。基本吻合设计思路。
2。然后我把 NgAgo&gDNA & (P) using co-transfection into podocyte.
我们也可以看见微弱的绿色。
请问， 下一步应该怎么验证？请详细说明。不要乱喷。我是做实验。
希望可以有所发现
非常感谢！ |
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c********n
发帖数: 225 | 47 【记录历史】NgAgo实验流程Addgene更新前后的比对
读好书，读好文，有益身心健康。
看文章，做记录，做总结，找原因，找规律，可以避免浪费以后的时间和精力
我们来记录一下韩春雨实验室提供的NgAgo实验流程，
在Addgene 2016年8月8日 更新前后，做一下比对
Reference：
原始发表的protocol
doi:10.1038/nbt.3547-s1, supplementary information
更新后的protocol
Addgene Han Lab added tips 2016年8月8日
https://www.addgene.org/78253/
under “RESOURCE INFORMATION” section “Supplemental Documents”
先看title
更新前
A general protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing and examination (
T7E1 assay)
更新后
A general protocol of NgAgo/gDNA-mediate... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 48 实验流程第三步：
3.Genomic DNA extraction
更新前
3-1 48-60 hours after transfection, cells are harvested by trypsin digestion
. Four wells of cells are combined into a 1.5 ml EP tube.
3-2 For genomic DNA extraction, 500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，
100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml）are added
into each tube and mixed gently and sufficiently. Bathe the tubes at 55℃
for 2 hours.
3-3 200 μl Tris-Phenol and 200 ul trichloromethane are added into each tube
and mixed gently and ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 49 9月28日Joe Miano
Most of you have already moved on from this discussion but I wanted to chime
in one last time with our negative data in the mouse. Whether we used
original plasmid or a custom NgAgo that was codon-optimized for mouse with
untranslated sequences, a Kozak Methionine, and polyA tail the results were
uniformly negative. We used a 5' phosphorylated ssDNA (both IDT bought or
in vitro phosphorylated) along with the mRNA to codon-optimized NgAgo and an
HDR template we used successfully ... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 50 几个值得考虑的方式：
1。transfect a pool，然后再split，每个treatment分开作。
2。Stable cell lines--可以是一个pool（排除integration site问题），或几个不同
的克隆。
3。除了Dual-luc，还有其它co-transfect的reporter,如laz,或者一个不相关的
protein，用western来定量。 |
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