Y*Z
发帖数: 1301 | 1 生物猛男们，请回答以下我的生物问题吧，谢谢
本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
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Y*Z
发帖数: 1301 | 2 本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
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r*****t
发帖数: 4793 | 3 谢谢！
确实那段序列GC比较高，我是用Qiagen的tissue blood cell DNA purification的那个
kit提的基因组DNA，不知道怎么回事 |
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r*****t
发帖数: 4793 | 4 模板里有inhibitor是什么意思？ｔａｑ酶的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ吗？我用ｋｉｔ提的
ＤＮＡ，应该比较干净吧 |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 试一下phusion? 不过我的经验，plantium还是
挺好用的，高GC的我也批过，多数能批出来。少数
出不来的，换其他的多半也出不来。最容易做的就
是重新设计引物了。 |
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j*********o
发帖数: 237 | 6 takara的la-taq不错，但20kb还是够呛，我们以前实验室的极限是12kb |
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b****r
发帖数: 17995 | 7 我觉得也是，找SNP，成本太高，无论是测序还是array。STR informative 多了，找到一个很可
能就是多态的。
但STR也不是那么容易做的，主要是数量太少，定位精度不够高啊，看楼主要求的精度了
。如果有core帮忙会好点，但是结果恐怕也是要有点经验才能看的。STR最多的是CA二核苷酸重
复，我们以前用ABI推荐专门扩STR的gold taq，PCR扩起来“滑动”很多，一堆的峰，没经验的不
知道哪个峰是真的，呵呵 |
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D*a
发帖数: 6830 | 8 什么叫被误导啊，本来生物是怎么回事都没搞清楚。临床转换效率当然低
但是如果把那些转换不了的都砍了转换效率就高了？
谁想到搞古细菌的弄出个Taq来？
水母发光又有什么好研究的？ |
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w**t
发帖数: 52 | 9 我以前也遇到这种问题，你可以尝试使用dITP，不过有一定的bias，或者是用chemical
mutagensis。
不过最简单应该是多做几管PCR吧，反正taq便宜啊。 |
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z********i
发帖数: 610 | 10 MS找到了两个相互作用的蛋白。最初克隆基因的时候发现不容易做出来，不得已用了
Taq酶，测通之后发现有四个点突变（K and E都有)，当时没有太在意，就这样做下去
了，发现有很强的相互作用。克隆的这个基因是kinase，做了KR突变之后,发现KR和WT
的作用一样(reporter assay)，我心里就有点疑惑了,当然kinase-indepdent的效果也
是有可能的。内源的相互作用没有做，在没有拿到confirmed的data之前，估计老板也
不会买抗体。
期间用pfu还是把这个基因克隆出来了，重复了一下原来的实验，发现重复不出来以前的结果，相互作用很弱，可有可无的那种。
难道我以前看到的是假象吗，真有这么点背的吗？ |
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f****s
发帖数: 133 | 11 我觉得还是留在牛老板实验室好，钱，我是说科研经费和奖学金通常比较有保证
想我呆在AP的实验室，本来项目进展还比较顺利，结果现在老板的R01很可能renew不上
，现在买个shRNA都付担不起了，本来要用的细胞系也买不起了只能管认识的人要别人
也是爱答不理的，更不用提本来我proposal里写的动物模型了，提RNA以前是kit现在是
trizol，做qPCR以前用supermix现在都自己配还用中国产的taq误差很大有时做几次就
有几次完全不同的结果，几乎所有的buffer都是自己配的出问题都不知道怎么
troubleshooting哪个环节都可能会出错，现在枪头都是自己买大包自己装盒子里用，
养细胞的大flask还得涮涮重复使用，一周一半的时间在准备这些玩意儿，下个学期还
要去做TA能做实验的时间就更少了，CHIP我都是自己设计N多个引物看能不能碰运气扩
出来，旁边的实验室的哥们做类似的项目都用上CHIP-seq了，结果好省时间还学到新技
术，每次committee member见面问我进展我都不知道怎么说了
还犹豫啥呢，楼主？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 12 长期影响上面有人说过了，短期影响，生物学发展这几十年一百年，人类搞清楚了输血
，搞清楚了成功手术之后为啥会死（感染），搞清楚了传染病流行机制，发明了很多疫
苗，癌症认识得清楚了些（放疗，化疗，转移等的理论基础），寻找合适配
型移植器官（MHC）以及抗排异，mutant小鼠来拥有可以试药的模型，PCR的灵机一动以
及发现Taq polymerase和微卫星序列等在法医鉴证学的应用（现在都开始玩线粒体dna
了，至少是csi里）。
好吧，这些都是一个或者几个lab发现的。
那么你去看看他的原始论文，是不是有一个共同的部分叫做“reference”，那里是不
是有几十篇引文，每一篇引文里面是不是又引用了几十篇引文？
说白了，卖房子，卖车，炒股，去华尔街，对人类能有什么用（华尔街毁灭人类好像有
点儿用）？
再说下去，这些经济学的交易模型，不一样是大学里不挣钱的教授提出来的？
有人有使命感，不计较钱，有人其实根本不关心有用没有，他关心的是工资。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 13 逆转录酶，可以继续合成cDNA，同时也可以像Taq酶一样，以DNA为摸版，扩增DNA。 |
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o********r
发帖数: 775 | 14 这样的老板以后会不会让你们自己表达提纯RE/Taq？大家都做lab tech算了 |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 我知道多数做microarray的实验室都自己做Taq，还有偷偷做pfu的.
我们实验室原来做PCR比较多，每个礼拜几百上千的，都去买岂不是饿死 |
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w******n
发帖数: 767 | 16 推荐invitrogen Taq PCRx DNA Polymerase，一个半年没批出来的基因，用这个搞定了。 |
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o*****r
发帖数: 156 | 17 片段这么小，换Taq也应该没问题，而且可以知道是不是pfu的问题了。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 18 普通的 最便宜的 NEB Taq
不用高保真，就看他扩增的长度 跟PFU 的对比一下就知道了 |
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a*******u
发帖数: 2 | 19 请问PCR扩增8kb的一个基因是什么难度？
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人或小鼠的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师觉得一次扩增
这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其中片段都不成
功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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a*******u
发帖数: 2 | 20 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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h**********r
发帖数: 671 | 22 pfu的PCR产物回收后加普通taq,不加引物，加dATP,没有的话dNTP也可以。直接68或72
度干个20来分钟，回收连T载体。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 23 要克隆一个promoter出来，但是从genomic DNA做模板怎么都PCR不出来，好几天非特异带，每一个和预期大小一致的。梯度也做了，
Taq也换了。很郁闷啊！
有经验的指点一下！谢谢了！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 24 关键是哪些极少数人做出来的是关键技术呢？
还是那个例子，搞古细菌的搞出来taq酶，搞为啥水母发绿光的搞出来GFP
再说，就算博后博士一个不少，如果真的从明天全生物学术界大家都保证朝九晚五周末
休两天，paper的发表率绝对能马上慢50％ 。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 25 从明天开始，把paper减少50%，
90%的生物进展仍然能够保留。
关键是哪些极少数人做出来的是关键技术呢？
还是那个例子，搞古细菌的搞出来taq酶，搞为啥水母发绿光的搞出来GFP
再说，就算博后博士一个不少，如果真的从明天全生物学术界大家都保证朝九晚五周末
休两天，paper的发表率绝对能马上慢50％ 。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 26 the point is, how do we predict which 50% should be reduced?
还是那个例子，搞古细菌的搞出来taq酶，搞为啥水母发绿光的搞出来GFP |
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s******r
发帖数: 2876 | 27 不需要predict，
难道少了一半的人，就会没有人去研究嗜热菌，水母？
只要是有趣的问题，就会有人去试图回答。
the point is, how do we predict which 50% should be reduced?
还是那个例子，搞古细菌的搞出来taq酶，搞为啥水母发绿光的搞出来GFP |
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s********8
发帖数: 619 | 28 最近试了一下phusion+topo cloning,我也是PCR纯化后加taq 20分钟,但是连不上.
我理解如果PCR纯化过了再加A,就不用再纯化了.
如果PCR完了直接加A,马上topo clone,应该也可以 (according to topo manual),但是我没试过,哪位试过的同学来说说? |
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d***y
发帖数: 8536 | 29 phusion后純化一下。然後taq加A。加完A后就不要純化了，直接拿去做轉化，用化學感
受態的ecoli就可以了。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 30 Green Taq不错，我都用来做PCR screening.
had |
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Z******5
发帖数: 435 | 33 只有多试几条引物了。
但我做的和你不一样，我设计的引物用普通Taq或者即使是专门扩高GC的kit也有很多非
特异性的，但是用Real Time的kit就非常好。 顺便说一下我用的是Brilliant
Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene)
另外引物拿到后就不要用普通的试来试去了，没啥意义，直接找几种做Real Time的kit
上就行了。 |
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d**********t
发帖数: 20415 | 34 100bp。。。用taq也不容易出突变啊
干啥用的？ |
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d****u
发帖数: 1553 | 35 Hi fi taq, accuprime pfx都挺好用的，前者效率更高。 |
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g*****d
发帖数: 27 | 36 谢谢楼上的，不同的primers都试过了，不同的水也试过了，不同的dNTP
concentration也试过了。用的是bulldog的Taq，都会出现size相同的dimers. 但是奇
怪的是用QPCR的mastermix试过后，出现了不同Size的bands。真是相当奇怪。
sequence在lab的电脑上，周一才能拿到。请楼上的兄弟帮忙分析下，谢谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 High fidelity taq is also ok bah |
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S**x
发帖数: 25 | 38 不好，但是理论上可以用。
the terminal transferase activity isn't 100%
好像从前在哪里看到，70％ pcr product 左右有一端加a
i personally prefer phusion from NEB.
and sometimes I use phusion+taq mixture for difficult PCR reactions. |
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h***e
发帖数: 146 | 40 我也经常做
引物有80甚至100bp的尾巴
高GC可以加DMSO
我们都是用50ul体系 酶有Phusion或者5primer的taq很好pcr的
楼主莫非是要做recombineering？ |
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g***y
发帖数: 201 | 41 1. use betain instead of DMSO. I tried them side by side and found that
when I used DMSO, there was increased error rate.
2. try phusion:taq 1:1 mixture instead of phusion alone. |
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k*********7
发帖数: 49 | 42 实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天——周末。
在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来 的时候
还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套──那么大，不知是哪一年买
的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿 实验服呢，你
的破大衣都可以当抹布了。
小女孩只好一个人做实验，一双小手被PE手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串点样
孔，还有好几管菌落pcr产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过她。
可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头发上，那头发
卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满了文献，实验
室飘着一股LB培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间——她可忘不了这个。
她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说，因
为她试了所有的taq酶，试剂盒，质粒，没p出阳性的菌落，老板一定会骂 她的。再说
，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有paper，虽然网上有好多类似的文献，但
到她这里就是不work。
她... 阅读全帖 |
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M********r
发帖数: 23 | 43 我做过3kb的，效率比2kb以下的要下降很多....
建议用takara的LA taq+GC rich buffer （I orII），这个高保真酶会自己加A的，所
以省一步效果很不错的。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 RE:
not expensive blunt TOPO
but alternatively you can try
another ligation-anchored PCR protocol:
details just go to
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31517723.html
2F
from our experience even over 7.5kbp with a very longer 3' UTR mRNA (for
alternative splicing functions
possible) can be full cloned its ORF plus 5' UTR and near 3' UTR (3kbp)
then TA sub cloning
with TOPO TA kit:
htp://products.invitrogen.com/ivgn/product/K450001
Taq |
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t*****P
发帖数: 36 | 45 非常大的分子7000bp，PCR不出来
是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
谁有经验，请指教啊 |
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S*********s
发帖数: 304 | 47 从cDNA中clone一个6k的gene
Phusion号称可以，但效率仍然很低。
分了两段，每段3K左右，band非常清晰。
中间加个site,可以做silent mutation,增加可用的site. |
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m***y
发帖数: 627 | 49 Roche的long template pcr kit 应该能搞的定，我p6点几kb的一次搞定，估计你的7kb
也压力不大，可以试一下 |
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