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w********r
发帖数: 1431 | 2 cmft
不过你们都不分装啊？直接1ml你吸我吸大家吸么 |
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l******a
发帖数: 3339 | 5 下次分装，谁知道那个糊涂蛋是不是把样品加酶里了。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 8 -20啥菌也长不了那么快。
很简单，要不自己把管子弄错了。要不就是有人捣鬼。 |
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q*******8
发帖数: 768 | 9 本科在遗传实验室做过一段时间，他们没有排枪，加样速度那个叫快！！！速度是要练
的，至于防止出错一般就用左手手指盖住前一个管子这样，反正PCR，不是蛋白质，也
不是LCMS，手指盖盖也没什么大问题，另外就是那个LS大家说的枪头盒对应。。。我现
在做PCR还是延续这个方法，不过他们最后加TAQ好像，就点在管壁上，然后用石蜡油一
举冲下去。。。这条被我遗弃了 |
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j****x
发帖数: 1704 | 10 DNA模板中包含dU碱基（由dC deamination而来），一般的高保真聚合酶比如Pfu无法正
常扩增。Taq酶可以扩增但本身错误率较高。
哪位知道何种高保真酶可以完成这种non-canonical base pairing？fidelity越高越好。
多谢！ |
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c********u
发帖数: 250 | 11 PCR tdtomato 总是有两条带, 大的1400多是对的,小的差600多,我知道tdt是dimer,可
是tdt 5' 3' 各有21和24bp是unique的啊,我用的就是这些primers,肯定不包含在重复
的那部分里,为什么还有两条带呢? PCR条件,62-55 touchdown,普通taq. |
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i*****g
发帖数: 11893 | 12 要研究一个技术，300万RMB 不够，3000万都未必够。
此话怎讲呢？ 3000万RMB，在美帝不就是 5-10个 R01 grant，
要5-10个R01 就解决一个大问题，那也太便宜了。
美帝每年1万5千个R01， 解决几百个问题，产生几百个中小公司，将来能成为100个世
界巨无霸的。 哪有那么便宜的事情？！
要是有订单，做摇床，离心机 倒可以，但问题是，现在做这些的小企业也不少呢。
我觉得还是做试剂（抗体，enzyme, growth factors，Taq）简单。问题是销售是个大
麻烦呢，谁认识你，谁愿意用你的试剂？ 你做出东西来 直接耗材成本100，销售成本
1000， 人力成本300，卖不出去，破产了。 |
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l**********e
发帖数: 146 | 13 1.5kb，怎么pcr，怎么成，没啥担心的。即使GC高，换个LA taq也就成了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 GC contents of that P2 to AscI site if >65% DMSO 5% to buffer or try
Clontech GC rich kit
Cycle time 35 that is no problem
pls refer
GC-rich PCR concerns DNA templates with high GC content, which is defined as
the percentage of guanine-cytosine base pairs. When amplifying templates
with >60% GC content (i.e 5' ends of most mammalian cDNAs), the three
hydrogen bonds shared by GC pairs lead to enhanced thermostability, which is
problematic for un-optimized Taq polymerase systems.
http://www.clon... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 16 1.跑胶clean-up会污染什么东西，抑制ligase. PCR products只好跑胶clean-up (
Qiagen kit). 载体就不必了.
2.酶切位点外要多出３-５个核苷，以确保酶切。
3.如果用的是Taq，酶切位点突变（可能性极小）。
TA也不成，看来２，３都不大可能是问题。但是，不妨考虑。
试试TA TOPO。然后再切下来装到你要的载体上。 |
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m******e
发帖数: 459 | 17 关于基因组DNA抽提纯化，用Qiagen的kit当然得率更高，纯度更高，但成本也高。我对
哺乳动物或者植物基因组提取没有经验，但是从酵母细胞中提取基因组我一般都是手提
，用异丙醇沉淀粗提基因组的上清，用TE溶解沉淀后加RNAse（确保没有DNAse污染）处
理，然后用酚氯仿抽替两次除去RNAse和残留的nuclease，最后加乙醇沉淀后测吸光值
定量。
关于探针克隆后测序，我觉得主要是确保序列是你想要的探针片段，因为不能排除直接
从基因组扩增出来的非特异片段正好跟你的探针大小一样。
关于探针突变的问题，如果你用末端标记法标记探针，PCR引入的点突变可能会有影响
，但是如果你是用切口平移法或者最常用的随机引物标记法，那么影响基本可以忽略。
我只用过随机引物标记地高辛和磷32,用普通taq酶做PCR完全没问题。 |
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z********4
发帖数: 701 | 19 有没有proof reading功能对保真性影响很大，但是活性中心本身也是一个因素，不同
来源的DNA聚合酶活性中心差异导致的保真性差别也可以是量级的。不过商业化的PCR用
酶基本都是复制型DNA聚合酶，即使没有校正功能保真性也是很高的，Taq在标准条件下
也是4－5万个碱基里面出个突变，用来clone一般够了，多挑几个克隆只要运气不是太
差应该没问题。 |
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m*******u
发帖数: 173 | 20 try some other Taq, like KOD Extreme |
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a****d
发帖数: 1919 | 21 I have been using primestar from takara. It works great so far. |
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j****n
发帖数: 3370 | 22 Why not just phusion or q5?
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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e**e
发帖数: 166 | 23 25个克隆 最后一个总是有问题 不是突变就是空质粒。
问一下 KapI BamHI双酶切的质粒可以冻在－20 反复用吗？好像旧的很容易自连。
另外， KOD 和Phusion总有突变。 大家还有更好的Taq酶吗？
接着做。 我就不信筛1000个没有一个对的。 |
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r******g
发帖数: 600 | 24 platinum hifi taq works really well in my 260bp cloning |
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l***y
发帖数: 638 | 26 普通100bp的cloning随便用个渣taq都没啥问题，长片段或者高GC的才考虑搞个好酶 |
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x********e
发帖数: 35261 | 27 100bp内突变率很低的 就算Taq精确度也差不到哪去
说到底fidelity都是看概率，你才100个碱基，要p多少个cycle才出一个错啊 |
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a***y
发帖数: 19743 | 28 Phire direct PCR from Thermo
成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 29 我是做MLST，用的是普通Taq酶，我试验过几个基因和几组引物都不行，一点点产物都
没有。
OE-PCR，如果我理解没错的话，用的不是原来的引物，而是跟原来互补的引物吧？ |
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a********k
发帖数: 2273 | 30 美国的试剂盒大部分不贵，Quest的HBV分子检测，试剂成本大概也就$3不到，一般保险
报销$48。你真以为中国的试剂成本能做到$3以下？质量可靠的Taq酶你都买不到。 |
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U**l
发帖数: 153 | 31 Taq polymerase for PCR
Channel rhodopsin for optogenetics
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 估计是下游有比较古怪的二级结构。建议加大DMSO的量，或者换一个Taq polymerase
knockout |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 没啥特别的， 就是把各种东西，包括buffer, dntp, primer,water, sybrgreen, DMSO
, taq
polymerase 都先混合好作为母液，然后分装到管子或者孔里去。最后再把template 加
进每一个管子里，然后离心甩一下。
其实就是把公司的premix 自己装一下。 不知道这个是不是你想问的？ |
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b******9
发帖数: 102 | 34 1. Gibson assemble,这个就是设计引物的时候两个PCR片段之间（U6 expression
cassette可以分成一个固定的，一个包含 target sequence的可变的），PCR片段和载
体之间要有overlap。
2.ovrelap PCR：两个PCR片段之间有overlap，先单独扩，分别扩增完之后再用Taq酶拼
起来，记得加3%DMSO。回收完了直接连T载体。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 35 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
低点，3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点，我几乎每次都
能用上。其他的看运气，识别8 ... 阅读全帖 |
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j****n
发帖数: 3370 | 36 赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
同时也忽视了一些最基本的training
这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
Taq
well
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4 |
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r******g
发帖数: 600 | 37 从来没克隆过这么大的，问个naive question
你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
个步骤呢？
是不是BAC更适合克隆大片段？
Taq
well |
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x********e
发帖数: 35261 | 38 赞长帖！我觉得克隆看似简单里面却有很多小技巧，以后要多向你请教请教。
我那个8k序列，我也试过分两段克隆。两个片段都放TA vector里了，切一个片段下来
，死活连不到另外一个上面去。设计应该没问题。挑菌落小提以后只有带一个片段的载
体。我们实验室的技术员最近帮另一个人做分子克隆，也是一样的问题。
Taq
well |
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x********e
发帖数: 35261 | 39 不成功可能跟我载体也有关。我的连接产物都在12k以上，用的普通NEB competent
cells
Taq
well |
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s**********a
发帖数: 92 | 40 多谢前辈。太专业了，太详细了，太热心了，太感动了！
Taq
well |
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T*****e
发帖数: 247 | 42 看你的实验，你认为PCR没有问题，对吧。这种情况我可能会拿PCR产物测个序。确保确
实是你认为的序列。
TA cloning用的kit？ PCR结束之后怎么加的overhang？放了多久？有没有跑胶？哪一
步跑的胶？转化用的什么competent cell？
我的常规做法：
Q5扩增， 跑胶确定大小，胶纯化片段，用taq加3' overhang（PCR machine上72C
10min，然后4C，或者直接拿出来放冰上），然后立即做TA cloning （invitrogen的
kit），下面就是常规转化了
根据你的描述，我不知道你TA克隆前PCR产物放了多久，有没有过胶，有没有冻。我们
实验室一哥们说这些都会让overhang掉下来，我不知道是否真的如此。不过我这一套流
程从来没有失败过（如果competent cells没有问题的话） |
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b*****s
发帖数: 169 | 43 1.酶切后需要胶纯化再做连接
2.Q5之后要用PcR产物纯化kit纯化后再用Taq加A
3. T载体是pGEMT吧，有蓝色克隆吗？没有的话就是你的载体或是感受态细胞有问题，
或是抗生素用错了。
你的PCR有你想要的条带，一般不会是引物设计的问题了。
另外建议用0.5ul T 载体，10xligase buffer，加ligase，然后加的PcR胶纯化产物至
最终体积，4度过夜
祝好运！ |
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T*****e
发帖数: 247 | 44 模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板，而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR似
乎没有问题。
我喜欢你这句"你将无法得到菌神的庇佑！" 看来你很enjoy实验 |
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n*******d
发帖数: 41 | 45 我九楼的内容指的是我在八楼提到的克隆方法的应该注意的点。
此法仅靠菌神做重组就可以，不需要额外加重组酶，不需要酶切连接步骤！
我个人本是非常enjoy实验的，只可惜目前跟ap老板观点总相左，正被老板疏远中！
：模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板，而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR
似乎没有问题。
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N******n
发帖数: 3003 | 46 [37;1m【 以下文字转载自 [+green]shelly2003 [+black]的blog 】
【 原文由 [+green]shelly2003 [+black]所发表 】[+reset]
【 以下文字转载自 [+green]S_LifeScience [+black]讨论区 】
【 原文由 [+green]Thrush [+black]所发表 】[+reset]
一、前言
原先我是准备等到毕业的那一天，痛痛快快地哭过了之后，一口气写掉这篇文章的。其实
一直在零散时间打腹稿，差不多已经煲熟了。刚才有同样读博士读得凄凄惨惨切切的师兄
表示期待，于是一横心决定现在就写了。何况，早点让更多还没上博士这条船的弟妹们看
到，提醒他们读博要谨慎谨慎再谨慎，能多挽救一个像我们哥俩这样不是读博的料的孩子
，也好。
文章原先是分八篇发表的，现整理为一整篇，每一部分加上原先的标题。
有几点要说明的：
1.或许有人嫌太长了不想看，或许我的观点片面甚至偏激，或许我的经历太特殊而不具备
代表性。但是无论如何，请点进来看的每一位想要读博士的朋友，还包括尚未高考的小朋
友和他们的爸妈们，切记，在做出选择之前做... 阅读全帖 |
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c********y
发帖数: 22 | 47 要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
求帮分析原因。。。 |
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i**********a
发帖数: 1402 | 48 genomic dna pcr的时候浓度不能太高，多稀释一下，引物3'端以g或c结尾。我做一般
用kod酶，现在谁还用taq。 |
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n**u
发帖数: 87 | 49 1kb 左右？ 合成吧 也就五天就合好了
：要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
：引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这 |
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x****6
发帖数: 4339 | 50 Taq polymerase有crispr这么让不止是学术界还有公众这个么high过吗？ |
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