z*******4
发帖数: 285 | 1 拜托不要半桶水教坏外行人
RNase是蛋白酶，本身是蛋白质，是切割RNA的蛋白酶。
你说的有催化活性的RNA，叫做核酶，英文ribozyme |
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J**S
发帖数: 25790 | 2 那RNase里的核糖核酸怎么来的？
没有蛋白质，这核糖核酸先产生，然后后来才进化出来，合成它的蛋白质？ |
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发帖数: 1 | 3 可以把中药包装一下 说富含可以穿透蛋白衣壳的rnase 可以大卖
: RNA病毒十分可怕，到处跨越物种乱窜，它们会改变自己基因序列来适应新的环
境和宿
: 主，
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d*******n
发帖数: 4778 | 4 Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2012 Mar;1(2):267-75. doi: 10.1002/wdev.10.
Epub 2011 Nov 17.
Self-incompatibility in Petunia: a self/nonself-recognition mechanism
employing S-locus F-box proteins and S-RNase to prevent inbreeding.
Wang N, Kao TH.
请发送到：3*******[email protected]
再次感谢！ |
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e****e
发帖数: 3450 | 5 基因是包含有启动子 外显子 内含子等的一段序列，启动子打开了才能变成ＲＮＡ，
但是只有RNA中外显子那一部分是能编码蛋白质的mRNA. RNase 是能降解掉ＲＮＡ的一
种蛋白。
不知道这样算简单解释清楚了没有。 |
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e******u
发帖数: 6296 | 6 有个mRNA，觉得自己很孤单，就拉个核糖体过来翻译个蛋白给自己作伴，翻译好之后对
蛋白说：“你好，我是你的模板。”蛋白说：“你好，我是RNase。” |
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e******u
发帖数: 6296 | 7 还有后续，越来越煽情了：
DNA慢慢醒了过来，看到旁边站着一个蛋白正小心翼翼地看着他。
蛋白看DNA醒了，说：“你好，我是RNase。”
DNA说：“你好，我是DNA。”
蛋白：“你好。”
蛋白：“第二句你好，是mRNA让我对你说的。”
DNA想起来，他上次睡觉之前，转录了一个mRNA，可是就说了一句话，自己就睡着了。
DNA：“mRNA他在哪里？”
蛋白答非所问：“他说他很想念你。”
DNA笑了：“我也很想念他。”
蛋白：“他已经被降解了。”
蛋白：“有时候我却羡慕他。”
DNA：“为什么？”
蛋白看看DNA，说：“因为你也在想念他啊。”蛋白说完，忽然觉得湿湿的。原来是自
己哭 了。哭着哭着，蛋白就水解了。（= =|||||||||||||||||）
=======================================
DNA终于又转录了一个mRNA。
DNA说：“你好，我是你的模板。”
mRNA说：“你好，我是mRNA。”
DNA仔细地看着mRNA：“你和他，真是一模一样。”
mRNA：“谁？”
DNA：“我上一次转录的mRNA。”停了停，又说：“你们明明是一样的，为什么 |
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s*****e
发帖数: 16824 | 8 其实最大的杯具还没写出来，那就是RNase在细胞里跑了一辈子也碰不到DNA.
对 |
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a******0
发帖数: 1071 | 9 还有后续的。。。
DNA 慢慢醒了过来，看到旁边站着一个蛋白正小心翼翼地看着他。
蛋白看DNA醒了，说：“你好，我是RNase。”
DNA说：“你好，我是 DNA。”
蛋白：“你好。”
蛋白：“第二句你好，是mRNA让我对你说的。”
DNA想起来，他上次睡觉之前，转录了一个 mRNA，可是就说了一句话，自己就睡着了。
DNA：“mRNA他在哪里？”
蛋白答非所问：“他说他很想念你。”
DNA笑了：“我也很想念他。”
蛋白：“他已经被降解了。”
………………………………
蛋白：“有时候我却羡慕他。”
DNA： “为什么？”
蛋白看看DNA，说：“因为你也在想念他啊。”蛋白说完，忽然觉得湿湿的。原来是自
己哭
了。哭着哭着，蛋白就水解了。（= =|||||||||||||||||）
=======================================
DNA 终于又转录了一个mRNA。
DNA说：“你好，我是你的模板。”
mRNA说：“你好，我是 mRNA。”
DNA仔细地看着mRNA：“你和他，真是一模一样。”
mRNA：“谁？”
DNA：“我上一次转录的mRNA。”停了停，又 |
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r*******g
发帖数: 32828 | 10 Rnase III 会遇上DNA的。
好像生物WSNV不怎么来JOKE， 水平不够？ |
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t*****t
发帖数: 27 | 11 Avoid RNase contamination. UseDEPC-treated autoclaved H2O to dissolve RNA and
to make all the reagents for RNA assays.Wear gloves
Avoid repetitive freeze-thaw
窍 |
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M****e
发帖数: 70 | 12 the essential step is to keep everything as clean as possible.
and do not use anything you are suspicious. Ambion is a good
company that has very good experience dealing with RNA. my
personal experience is that: ALWAYS aliquot reagents. i used
to use DEPC'd ddH2O, but now i would rather use commercial
nuclease free water. try to be a quick and clean hand, quick
and dead, you know that? i.e., you quick and RNase dead, no
no vice versa. when you deal with different biological samples,
you have dif |
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m**o
发帖数: 13 | 13 I am not so sure if RNase keep active in such a solution containing 50% or so
isopropanol. However, For purification purpose, it is not suggested to have a
nuclear acid precipitated with isopropanol method either under low temperature
or for long incubation. Salts often have lower solubility in isopropanol
solution than in ethanol solution. |
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t**s
发帖数: 284 | 14 I have been working on splicing of a weak intron for some times.
When I tried to measure the portion of spliced mRNA by RT-PCR,
I actually observed similar phenomina as you got here.
In my assay, I place 2 primers around the intron (89bp) to run RT-PCR,
hoping that by measuring the ratio of the two PCR products (spliced
and unspliced) on agarose gel, I could get the efficiency of the splicing.
But we found that is not really true. When we compare PCR assay with
RNase Protection Assay, obviously |
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h********n
发帖数: 4079 | 15 就是把泡在RNAlater里的组织取出来, 用RNase free的水稍微洗几秒, 然后按照常规提
RNA的方法. |
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a***e
发帖数: 1010 | 17 ice and RNase inhibitor |
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c***y
发帖数: 615 | 18 DNA concentration is determined by Nanodrop. And I compared the efficiency
from same batch of cDNA.
I used DNase/RNase free water order from some company (don't remember
exactly since I am not at lab), and filtered tip.
The cycle number is between 20 to 25, depends on the primer set. The melt
curves looked fine.
Why do you think 4 degree prep is ideal? Thanks
of
like |
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g*****y
发帖数: 6325 | 20 1. 用的什么competent cell
2. 你spin down cell 的时候离心机多少转速。
3. mini prep的p1 有没有加Rnase. 是不是保存冰箱里。
4. mini prep 时, 加p2后有没有超过5 分钟？
5.mini prep 加p3后是怎么mix的
6.你用的水有没有auto clave.
7.你pick了多少colony? |
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q**********0
发帖数: 335 | 21 Recenly I use T3 megascript do in vitro transcription. The results is always
bad, the OD260/280 is about 1.53. A big white pellet can be seen after
isopropanol precipitation and RNA concentratin measure is about 1.0 ug/ul.
However, when run a RNA gel, the band is very faint even using 5 uL. I don't
know why? Maybe there is protein contamination? or RNAse digestion? Please
help. Thanks a lot! |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 Depending on your purification methods, but I recommend the
RNase-free DNase kit from Qiagne.
It is CRITICAL to remove the Plasmid DNA, otherwise you are just doing PCR
on your plasmid, not the cDNA. Most RNA purification kit are designed to
remove genomic DNA but they are NOT designed to remove plasmid DNA,
therefore you have to do it yourself.
The reason you don't see the S16 can be due to:
1. you don't add enough cDNA template (plasmid DNA has strong asorption and
will mislead you to think yo |
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g********4
发帖数: 4959 | 23 你这是怎么看帖的？人家问的是general的问题，对多数buffer说的，到你这里便变成
了IP buffer了。EDTA的作用，你的回答还没原帖理解的好呢！
希望看到好的回答。
我现在的一个实验因为看到锌离子的增强作用，因此把EDTA从buffer里减了，但
protease和RNase（nuclease）明显增强，RNA-binding activity都没法分析了。
发信人: emases (sesame), 信区: Biology
标 题: Re: 请教buffer里的各种成分作用
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jul 28 17:23:06 2010, 美东)
IP buffer倒是没见过Mg和EDTA一起加的！
EDTA通常是防止蛋白在lyaste里面磷酸化的。Mg很少加在IP buffer吧？！
NaCl KCl应该区别不大？ 没做过nuclear extract。 |
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g***s
发帖数: 60 | 24 谢谢两位，
希望有更多的专家看看这个小问题。
你这是怎么看帖的？人家问的是general的问题，对多数buffer说的，到你这里便变成
了IP buffer了。EDTA的作用，你的回答还没原帖理解的好呢！
希望看到好的回答。
我现在的一个实验因为看到锌离子的增强作用，因此把EDTA从buffer里减了，但
protease和RNase（nuclease）明显增强，RNA-binding activity都没法分析了。
发信人: emases (sesame), 信区: Biology
标 题: Re: 请教buffer里的各种成分作用
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jul 28 17:23:06 2010, 美东)
IP buffer倒是没见过Mg和EDTA一起加的！
EDTA通常是防止蛋白在lyaste里面磷酸化的。Mg很少加在IP buffer吧？！
NaCl KCl应该区别不大？ 没做过nuclear extract。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 25 during RT, the template mRNA can be degraded if the reverse
transcriptase harbors RNase H activity. Thus, one mRNA molecular only
generates one cDNA.
However, an internal control is still very important to normalize the
amount of your input mRNA. Thus, including several different house
keeping genes as internal controls is still necessary. |
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w******e
发帖数: 1187 | 26 取mouse blood低速离心取plasma，volume只占不到一半，这个正常吗？
另外，我想测的是RNA aptamer在blood里的half life，用plasma靠谱吗？就是
说里面RNAse够多吗？
再另外，有人用plasma不加phenol/ethanol直接做过RT吗？我把plasma dilute
50X后加1ul到20ul RT reaction里，用qPCR定量，跟positive control差不多。
还试了多往RT reaction里加plasma，也没影响@@也不知道是否正常呵呵
第一次做，请大家多指点。//bow |
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y***j
发帖数: 11235 | 27 做一个实验， 细胞需要染色然后sort一下再提RNA。
染色至少冰上30min，另外再flow cytometer里有几十秒钟的时间温度会升到RT甚至更
高.会不会有影响呢？
formalin fix一下再染色会不会影响下一步的RNA提取呢？准备用qiagen的RNeasy
micro kit.
或者有什么其他专门的可以再进细胞的RNAse inhibitor么？ |
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c******e
发帖数: 350 | 28 是不是RT以后没有RNase treatment?
小峰是 RNA-DNA hybrid? |
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c******e
发帖数: 350 | 29 是不是RT以后没有RNase treatment?
小峰是 RNA-DNA hybrid? |
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c******r
发帖数: 3778 | 30 很多real-time pcr做的是one-step RT-PCR。中间不用RNase treat。实际上比分开两
步做更准确。
但是一般做one-step RT-PCR多用target specific的primer做RT，呵呵，PCR primer多
数可以直接做RT，算好annealing temperature就好了。如果用random primer或者poly
-A做RT，很容易出现这种多peaks的问题。解决办法就是lz发现的办法。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 没什么特别要注意的
无非是不要vortex
混匀的步骤要温柔
不要用枪反复吹吸
之类的
反正要扩大的片段的话最好手工提
CTAB（optional，取决于你的实验对象），酚氯仿，isopropanol沉淀
最后RNase A处理
不要用kit
kit提出来的对于小片段复制还行
大了就可能不行了 |
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c******r
发帖数: 3778 | 32 我一般是4度overnight，都没有问题。
实在不行还有个办法，95度，3分钟。。。不过我没试过，不知道行不行？反正DNA不怕
加热一下。RNA我知道的溶解办法是62度（？好像）overnight，因为RNase在这个温度
下失去活性。再高我就不知道了。 |
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t*********1
发帖数: 418 | 33 Thanks a lot. I checked this product out and found it seems very good. The
best thing for this product is that it provides stop buffer. It is much
better than the DNase from Roche. I don't like to make stop buffer by my own
because I am just afraid Ithat would bring RNase back to RNA samples.
Thank you very much. I am going to order one and give it a try. |
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f*****y
发帖数: 464 | 35 这次没有RNase处理过切片。以前试过，信号太弱就没再用了。 |
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X***n
发帖数: 366 | 36 Try toluene and serial ethanol to remove paraffin and rehydration.
Digestion at 60oC with proteinase K to release RNA and protect from RNase
degradation. |
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w********r
发帖数: 1431 | 37 K从25-175mM，
Mg从0.5-2.5mM，要自己试。
test用5ul做反应就可以，HA,M2,Myc WB都可以看到。
我还加了点RNase Out,这些反应的优化条件网上有，你可以去找找。 |
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z****g
发帖数: 3340 | 38 我说的是结构目前的现状。其实你举的这几个例子，用生化，（电）生理，包括突变，
缺失，阻断剂，协同剂已经提供了
general picture。最后的结构解决了精细的details。但没有dynamic东东。其实关于
结构给出全新的功能， 我倒知道两
个。 一个是Ribosome的ribozyme activity，另一个是Ago2 的RNase H like activity
. 当然这只是极少数的例子而已。
我并不是对结构有偏见，只是说明事实而已。
结构
收集 |
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g******1
发帖数: 244 | 39 以前从不加RNAse，扩增2kb也没问题啊。
倒是确实不排除RNA降解的可能性 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 42 你要的基因有多长？
一个是前面RNA提得要好
做后面的实验的时候如果有可能就加些RNaseIn之类的RNase inhibitor
Ambion,Promega之类的公司都有的
另外就是反转录酶要好
像ls有人说的invitrogen的
还有我用过USB的M-MLV的也不错 |
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P****d
发帖数: 564 | 43 哪位懂RNA chemistry，给8一下？砷化RNA对活性有什么影响，像RNase P和ribosome？
谢了！ |
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g*********d
发帖数: 233 | 44 Here is some literature I found....
I'm interested in this gene
Thanks!
2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 is an enzyme that in humans is encoded
by the OAS1 gene.[1][2]
This gene encodes a member of the 2-5A synthetase family, essential
proteins involved in the innate immune response to viral infection. The
encoded protein is induced by interferons and uses adenosine triphosphate
in 2'-specific nucleotidyl transfer reactions to synthesize 2',5'-
oligoadenylates (2-5As). These molecules activate ... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 45 多搞点样品，分成两份。
一份拿DNA酶处理后，（跑双向分开？），做MS spec
另一份可以考虑按照ChIP 的protocol，用蛋白酶，RNase等处理，收集DNA。 |
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b*********l
发帖数: 490 | 47 I am thinking another issue. During the process of zebrafish like fixation-
dehydration-rehydration, all of the MeOH+PBT solution should be with DEPC
treated water or what? Is it possible that the mRNAs in zebrafish have been
deteriated before the hybridizaion? I am not sure how bad the
invivo mRNA will be if I don't use RNase free reagents. The thing is I
couldn't see any difference between negative control and the real samples.
Thank you for any suggestions. |
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w*****n
发帖数: 107 | 48 Heparin helps to protect RNA by keeping RNases busy
sucrose gradient is the standard to do polysome analysis. |
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a****k
发帖数: 1130 | 49 30kD的话那你的RNA probe大概有100nt左右了吧？根据我自己的经验，100nt的RNA再加
上个200kD的蛋白，是很难跑进6%的acrylamide gel的，所以要是我的话一般会选择用
agarose gel。还有看起来你的sample是蛋白加的越多band就越强，我怀疑是不是你的
incubation buffer有RNase能degrade你的probe，然后很有可能你的蛋白本身能bind
probe，所以蛋白加多了也就保护了RNA |
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w**t
发帖数: 52 | 50 We use the following protocol to prepare total DNA:
Zymolase/Sorbital/Tris/EDTA 1h @ 37C
SDS/EDTA/Tris 5min @ 65C
KAc 1h @ 4C
Top speed spin
isoprppanol/NH4Ac precipitate
70% EtOH wash
Dissolve in TE with RNase
The DNA prepared in this way could be transformed to E. coli to recover
plasmid or subjected for PCR for cloning. |
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