c****1
发帖数: 1095 | 1 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
不知道我说明白没有。 |
l******u
发帖数: 936 | 2 直接 RNA seq 或者用 nano string
当然, 也许对多数实验室不太现实.
【在 c****1 的大作中提到】
: 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
: 如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
: 是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
: 内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
: 准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
: 时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
: 这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
: 那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
: 不知道我说明白没有。
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X***n
发帖数: 366 | 3 难道RT的时候没有升温解链过程也能线性或者指数扩增？
用genomic DNA作内参不行么？这个一般来说一个细胞就俩拷贝，恒定的。 |
a*****g
发帖数: 543 | 4 1） NanoString吧
2）assume mRNA-cDNA linear,用your favorite gene plasmid (算molecular weight,
molecule concentration) 做serial dilution, qRT-PCR.
【在 c****1 的大作中提到】
: 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
: 如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
: 是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
: 内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
: 准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
: 时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
: 这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
: 那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
: 不知道我说明白没有。
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c****d
发帖数: 501 | 5 用realtime pcr就可以了啊
但是你首先要有standard
比如说已知copy number的plamid dna
【在 c****1 的大作中提到】
: 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
: 如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
: 是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
: 内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
: 准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
: 时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
: 这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
: 那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
: 不知道我说明白没有。
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c****d
发帖数: 501 | 6 恩 我说的就是你们的#2
我们是用这个测HIV infection的copy #
比较省钱 -_-\\
weight,
【在 a*****g 的大作中提到】
: 1） NanoString吧
: 2）assume mRNA-cDNA linear,用your favorite gene plasmid (算molecular weight,
: molecule concentration) 做serial dilution, qRT-PCR.
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a***e
发帖数: 1010 | 7 during RT, the template mRNA can be degraded if the reverse
transcriptase harbors RNase H activity. Thus, one mRNA molecular only
generates one cDNA.
However, an internal control is still very important to normalize the
amount of your input mRNA. Thus, including several different house
keeping genes as internal controls is still necessary.
【在 c****1 的大作中提到】
: 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
: 如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
: 是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
: 内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
: 准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
: 时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
: 这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
: 那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
: 不知道我说明白没有。
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c****1
发帖数: 1095 | 8 测cDNA的拷贝数是没有问题的，可以用一系列已知拷贝数的DNA为摸版作标准曲线。现
在问题的关键是，能否用cDNA的拷贝数代替mRNA的拷贝数。根本的问题是：新合成的
cDNA会主动跟RNA解链么？如果可以，RNA可以再次作为摸版合成新的cDNA。这样问题就
出现了。 |
l******u
发帖数: 936 | 9 是的, 其实RT的过程问题很大的, 酶的作用以后都不能真实反应初始的mRNA情况了.
所以研究transcript, 以后的趋势是直接 digital read out.
nano string 已经可以做到了啊, 只不过这个东西太贵.
直接的 RNA seq 现在也还没开始普及.
【在 c****1 的大作中提到】
: 测cDNA的拷贝数是没有问题的，可以用一系列已知拷贝数的DNA为摸版作标准曲线。现
: 在问题的关键是，能否用cDNA的拷贝数代替mRNA的拷贝数。根本的问题是：新合成的
: cDNA会主动跟RNA解链么？如果可以，RNA可以再次作为摸版合成新的cDNA。这样问题就
: 出现了。
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H******e
发帖数: 14 | 10 http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/329/5991/533
Quantifying E. coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule
Sensitivity in Single Cells
Yuichi Taniguchi,1,* Paul J. Choi,1,* Gene-Wei Li,1,2,* Huiyi Chen,1,3,*
Mohan Babu,4 Jeremy Hearn,1 Andrew Emili,4,5 X. Sunney Xie1,{dagger}
【在 c****1 的大作中提到】
: 有个问题，一直没有找到明确的答案，还望前辈多多指点。
: 如果要比较某个mRNA在不同个体，或者不同发育时期的表达水平。一般的做法
: 是拿个内参（比如actin）作对照，然后比较这个相对值。但问题是，有时候
: 内参的表达水平也不一定是稳定的。这个时候，也许用绝对定量（也就是用标
: 准曲线计算出绝对拷贝数）更准备点。但是，这个也是有问题，因为在做RT的
: 时候，一个mRNA模板不止得到一个cDNA拷贝，因为逆转录酶的活性一直有。
: 这样一来，之前计算出来的cDNA的绝对拷贝数也只不能反映mRNA的拷贝数。
: 那究竟怎么才能绝对定量特地的某个mRNA呢？
: 不知道我说明白没有。
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