v***a
发帖数: 1242 | 1 PCR check看不到任何条带
是双酶切，用的另一个是MluI，引物前都各加了2个保护碱基
期待高见 |
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C******r
发帖数: 790 | 2 1、我是新配的hygro，应该还好吧，其他细菌不长
2、没搞清从哪儿要其他抗性的重组酶质粒，不过现在不归我做，也暂不多想了；伊新
搞了批BAC，希望能好用
3、听人说这个方法retrieval那步有时候会很困难，所以想改用传统PCR插入算了，没
想到传统方法也碰到怪异事情 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 3 不管是师姐还是师兄,都不如找一个做生物的男朋友：做不出的pcr和克隆可以让丫做，
如果不肯做，就分手。哈哈 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 4 男的给女的作了PCR和克隆,不过女的还是不太满意男的。
不知道有没有分手。 |
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w*e
发帖数: 740 | 5 在老鼠模型中，不同的细胞颜色不同
然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
谢谢 |
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F**********e
发帖数: 158 | 6 yes
I ever did this experiment using nest pcr |
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w*e
发帖数: 740 | 7 初步打算先用酶消化，然后测试细胞的功能，目前已经成功
下一步：
想通过RT-PCR来确定我们测试的细胞是不是MUTANT细胞。
因为我们是CRE/LOXP老鼠，不能保证所有细胞都是MUTANT细胞，而且不同的细胞，表型
也不一样
谢谢
cell |
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x********u
发帖数: 430 | 8 You can try alternative heating and cooling for breaking down the cell. 3X[
95C/1min and -80C/5min].
Try to use GoTaq Hot Start DNA polymerase.
If you still cannot get the desired band, try growing the cell in liquid
culture, and make genomic DNA by PureLink gDNA kit.
Since your fragment is around 200bp, why not just synthesize the sigle
strand oligoes and reconstitute your molecule by annealing on a PCR machine.
Good luck! |
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m********r
发帖数: 124 | 9 我拿到e.coli的genome后，PCR就非常容易了，
克隆已经拿到，这周就做表达了，谢谢各位了
machine. |
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J******r
发帖数: 2806 | 10 try Jeffrey's PCR buffer
enzyme is not important... |
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Z******5
发帖数: 435 | 11 大家做qRT-PCR的时候，一般是最后加模板还是最后加引物？
我觉得为了使定量准确，应该先加模板，然后分装，再分别加引物。
因为决定Ct值的是模板量，引物是过量的，先加模板分装后再加引物能够保证内参和目
的基因所使用的模板量差异达到最小。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
这个选项。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 “realtime PCR是个非常敏感的实验”
我非常同意这一点
换句话说，这个实验有很大的系统误差
说实话，是属于你做得越多想得越多越不喜欢不觉得可信的一种实验！
40% |
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Z******5
发帖数: 435 | 14 菜鸟弱弱的问一下，one-step RT-PCR指的就是Two-Step Cycling？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 15 我设计引物的时候都会设计成同一个退火温度的。一次PCR搞定，这样比较方便呢。
separately, with 3 replica .
separately, with 3 replica |
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Z******5
发帖数: 435 | 16 "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
测的基因"
这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
的。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 17 讨论总是有益的。自己算，即使能得出准确数值，但是得不出集体讨论所覆盖的广泛外
延。
做RT-PCR，不用过分追求百分之几、十几、甚至几十的误差。因为cDNA存在百分之几百
、几千的差别（也就是数量级上有差别），才会有蛋白水平上detectable的差别，才会
有意义。
Ct |
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j****x
发帖数: 1704 | 18 无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
30%，我猜想手工加之会更多吧
一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了 |
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Y*Z
发帖数: 1301 | 19 本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
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F***w
发帖数: 58 | 20 请教:
如果用gene specific primer 做反转录，做real time PCR的时候，怎么设置内参照? |
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o*****a
发帖数: 2335 | 21 比如俺们做microRNA的PCR就是用GSP...... |
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S*****s
发帖数: 287 | 22 优势是什么？我只做过 realtime PCR 不做 microRNA。在我看如果用 oligodT 就可以
拿 GAPDH actin 之类的内参做 control，测出来的 specific level 也更准确一点。 |
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h****g
发帖数: 439 | 23 可以再单独逆转录一次，用内对照基因的gene specific primer 或者oligodT。用这个
cDNA 来PCR 内参。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 24 首先，污染问题一定要解决。像楼上说的，把所有实验器具、试剂都擦擦或换新的。可
以考虑到超净台内做。
此外，最好不要做那么多的cycles，可以多设计几对nest PCR。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 25 请问能用胶回收的KIT回收PCR产物吗？就是最普通的Qiagen的那种。有人试过没有？多
谢！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 26 因为没有买PCR回收KIT,所以没有binding buffer~~可以自己配吧？
另外溶胶buffer加多少呢？又时候还得加点异丙醇吧？一般加多少？
多谢大家！ |
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W*********n
发帖数: 775 | 27 今天要做个real time pcr,测基因表达的变化（处理组相对于对照组），因为好久不用
这个仪器了，所以有一步骤有点忘记了：
我是用SYBR 染色，所以不用探针。请问在新打开的file里面应该是分析法法选择应该
是：
Absolute Quantification 还是 下面的 那个相对定量方法(ccCt) ？
我记得以前用的就是Absolute Quantification ， 现在有点拿不准了。
谢谢啦 |
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w**t
发帖数: 52 | 28 我以前也遇到这种问题，你可以尝试使用dITP，不过有一定的bias，或者是用chemical
mutagensis。
不过最简单应该是多做几管PCR吧，反正taq便宜啊。 |
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c*****e
发帖数: 619 | 29 260/280很好，1.8-2.0， 是因为ammonium acetate 没有洗干净，会影响PCR吗？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 30 说实话，我一直只看260/280，有时候还1.7几，照做pcr。。。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 31 we directly put cells in proteinase K, digest it, then inactivate proteinase
K, and then use the lysate as a template for PCR.
so it is shitty. |
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y**********o
发帖数: 37 | 32 我们的老鼠做genotyping时用的genomic DNA经过phenol-chloroform纯化后260/280
ratio都是1.4-1.5,根本不影响PCR. |
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a********k
发帖数: 2273 | 33 价格无所谓
不能太大
其实要做的实验很简单，就是一般的Syber green的realtime PCR
写出推荐理由的都有包子。谢谢了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 34 简单的Sybr green的话你就比比看谁便宜好了
谁便宜买谁
不做realtime的时候还可以当个普通pcr用 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 35 拿新开封的东西换个实验室做：）
另外我以前也遇到过类似的事情
水做negative control也出目标条带
不过我同时有加模板的反应
应该是形成了气溶胶进去了
后来我老板跟我说要抓主要矛盾
要时刻记得自己要解决的问题是什么
如果这种细节问题对大局没有影响
不要太纠结
当然后来我做就超级小心
都是配好master mix以后分管
先加negative control的水
然后封上
然后再加别的管里的模板
这样就好多了
不过有的时候还是会有一点点信号
对了，你PCR做多少个cycle？
做15个，25个之类少一点cycle试试呢？
如果是污染会要比较多cycle才能出来
封. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 36 1.可能没有全长cDNA
2.可能有全长cDNA，但是用的DNA polymerase没办法从你的模板里p 9kb
解决方法可以有
1.如果对cDNA质量有怀疑，重新制备
2.换DNA polymerase，我用过TAKARA的LA DNA polymerase，不过模板不是cDNA，是细
菌gDNA，
扩了13kb。模板是细菌gDNA还是人/老鼠 gDNA还是cDNA还有区别的，可以参考他们网站
3.既然小段的可以P出来，就重新设计引物，分两段或者分三段甚至四段扩，（互相
overlap)分别扩
好了以后再做mega PCR |
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c******r
发帖数: 3778 | 37 9kb不算太过分，上面葡萄mm做了13kb，但是9kb确实也比较长，rt可能需要调整一下
protocol。实在不行只能分段pcr，然后接起来 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 这个不太可能是反转录的问题，更可能的是你克隆PCR的问题，
因为９k有点长的，一般的酶没有那么processive |
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n**8
发帖数: 221 | 39 多谢大家的回复
PCR条件还好，因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的（11kb），这是我的
positive control。
我是怀疑我的RT有问题。 |
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n**8
发帖数: 221 | 41 多谢回复！
to院长，
想弄下来测序，看看怎么splicing的，还有看看predicted的motif还在不在，你之前说
的那个分段测序，我已经做过了，可是这并不能说明这个全长的cDNA存在啊？准备做
northern，但是也只能看size，具体的molecular lesion 还是不确定。
你说的这么长PCR出来不reliable，只是先粗测序看看，真正要最终高保真的克隆，当
然会分段做。
to Zifeng9527，
想搞全长的cDNA，自然尽量不会去用random primer 反转。 |
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l******g
发帖数: 1623 | 42 看看局部的GC含量?PCR KIT好不好用?
加DMSO,延长extension时间 |
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a*****f
发帖数: 30 | 46 引物设计了两种，一种21bp左右，Tm 62度左右，另外一种25bp左右， Tm 69度左右。
对于第一种引物，三步法PCR，退火温度58度，延伸时间2.5 min；第二种引物，两步法
，退火、延伸温度68度，时间3min。 |
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i**********5
发帖数: 261 | 47 dilute your template. dilute your template. often times, genomic DNA
solution contains tons of chemicals and proteins which are inhibitors of
your PCR |
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s********8
发帖数: 619 | 48 搭车问..最近也在做一个genomic PCR，5k的片段，用的是Pfuultra II HS fusion (
from agilent),怎么也P不出5k的片段，只有4k，3k的条带。。。
试了gradient，还是那几条带。
两条引物中的一条有mispriming，是应该换引物吗？还是换酶？ |
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i*****g
发帖数: 11893 | 49 加DMSO 可以到10%，
以前PCR过一个cDNA， N端严重hairpin |
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d******u
发帖数: 178 | 50 cDNA (from 2ug total RNA): 5ul
10X Pfx buffer: 12.5ul
10mM dNTP: 3ul
50mM MgSO4: 2ul
Fwd primer (10uM): 2ul
Rev primer (10uM): 2ul
Platinum Pfx: 1ul
dH2O: 22.5ul
_______________________________
50ul/rxn
+10X enhancer: 5ul
PCR:
94C, 5min
__________
94C, 15sec
60C, 30sec
68C, 3min
__________35X
68C, 7min
4C, for ever
我用PrimerExpress设计引物，标准60度Tm。 |
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