b****r
发帖数: 17995 | 1 你这个做了逆转录后用什么酶做PCR？ 大概多少个循环才行？要不要做nesting PCR呢？ |
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m*****y
发帖数: 857 | 2 you answered yourself. use nested pcr
呢？ |
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m*****y
发帖数: 857 | 3 do a gel band purification after your first round PCR |
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m**********2
发帖数: 6568 | 4 no need to think about.
all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not
here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on. |
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A********0
发帖数: 3310 | 5 use nested PCR or
semi-nested "用一端相同一端巢式的" |
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z*******9
发帖数: 112 | 6 我也遇到同样的情况，我想，可不可以通过增加第二轮PCR的特异性，例如，升高
anneal tm，个人想法而已，还没有实践过， |
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d****i
发帖数: 2346 | 7 第一轮产物泡脚，在你目的片段预期大小的位置切胶回收，胶切取的范围可以稍微大一
些，纯化后再做第二轮用梯度PCR。 |
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E***u
发帖数: 60 | 8 另外，请教一下，PCR重叠的时候需要特别的protocol么？
还是只需要用普通PCR protocol?
似乎不同的文章说法非常不一样 |
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S**x
发帖数: 25 | 9 不好，但是理论上可以用。
the terminal transferase activity isn't 100%
好像从前在哪里看到，70％ pcr product 左右有一端加a
i personally prefer phusion from NEB.
and sometimes I use phusion+taq mixture for difficult PCR reactions. |
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s******a
发帖数: 472 | 10 最近一直在和PCR较劲，至少有2个星期了。
用的上下游引物都是100bp（20bp的priming sequence），模板是质粒DNA，酶是
finnzyme HD hotstart polymerase。
特别难P出来，曾经走狗屎运P出来过，但是极其难重复。
哪位大拿能指点一下这么长的引物PCR的技巧吗？ |
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k*********7
发帖数: 49 | 11 实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天——周末。
在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来 的时候
还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套──那么大，不知是哪一年买
的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿 实验服呢，你
的破大衣都可以当抹布了。
小女孩只好一个人做实验，一双小手被PE手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串点样
孔，还有好几管菌落pcr产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过她。
可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头发上，那头发
卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满了文献，实验
室飘着一股LB培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间——她可忘不了这个。
她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说，因
为她试了所有的taq酶，试剂盒，质粒，没p出阳性的菌落，老板一定会骂 她的。再说
，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有paper，虽然网上有好多类似的文献，但
到她这里就是不work。
她... 阅读全帖 |
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a********k
发帖数: 2273 | 12 0,determine a pcr condition works for all primers
1,set up 50ul reaction
2,stop at 20 cycle, get 5ul to run a gel
3,5 more cycles, 5ul run gel
4,repeat 3rd step for 3 times
5,run a gel after 40 cycles
6,pick a gel to satisfy your boss
traditional PCR. |
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s*******s
发帖数: 623 | 13 overlap PCR中间重叠区域长度请教
两个各3kb的片段
中间重叠21 bp的话
overlap PCR够了不够？
thanks! |
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c******e
发帖数: 350 | 14 Thanks.
But maybe I didn't explain well what happened.
We set up 2 reactions with identical reagents on 2 thermocyclers as below.
thermocycler Capillary 96-wells
Ramp rate (C/sec) 20 2
PCR volume 10 ul 10 ul
Amplification success fail
The reason we changed the ramp rate is that 2C/sec is recommended for the
96-well thermocylcer.
We didn't change reagents or Taq, be... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 又一个 搞Protocol创新的
微细管PCR protocol 的 10 ul 用ABI 9700/9600 PCR thermocylcer 干
试出没? by HOT START
If positive next submit to
Nature Methods ? just guess |
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r*****5
发帖数: 1876 | 16 非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那样只用２个
PRIMER，用来做PCR， 对么？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 17 你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了，因为就是KO allele 和WT allele 分别。
genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖， 明天去了实验室给你找个图。 |
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a****o
发帖数: 2 | 18 忘了补充两点
the PCR products for making qPCR standard also had smeary bands. I had tried
my best to minimized it by nested PCR with low concentration of DNA
template. But I assume certain unspecific amplifications still remained in
the qPCR standard, which could lead to smeary bands for the samples of qPCR
standard. It however does not explain the existence of smeary bands for the
tested samples.
Another thing it the Ct value is smaller than usual. |
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C******d
发帖数: 362 | 19 谢谢啊
胶带不浓亮，比较暗。有时NTC样品，也有些更暗的胶带。
但是，我用常规PCR，试了下，得到很浓亮的胶带，只是常规PCR中，primer的浓度高很多 |
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a******c
发帖数: 597 | 20 这个好办。增大mRNA的量，逆转之后，换不同的high fidelity 酶，不同条件pcr，一
定能pcr出来。 我以前遇到过一模一样的问题。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 21 if extract mRNA for your qRT-PCR
LZ just try this one:
Oligotex™-dT30 (Super) mRNA Purification Kit
Protocol in chinese version:
//www.takara.com.cn/?action=Page&Plat=pdetail&newsid=185&subclass=1
how to get it in States:
//www.takara.com.cn/?action=Page&Plat=link
or Qiagen similar kit:
//www.qiagen.com/products/rnastabilizationpurification/oligotexsystem/
oligotexmini.aspx
PCR |
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D********0
发帖数: 409 | 23 1. dilute template，
2. 如果不work，把引物往里设计，primer binding的时候不能perfect match到原来引
物位置。
3. 如果不purify PCR product，里面焦磷酸盐之类的会降低PCR specificity and
sensitivity。
4. qiagen hotstar kit for amplification。 |
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d**l
发帖数: 1546 | 24 先把条带切出来， 然后用gel purification kit纯化， 然后再用普通的pcr
purification kit纯化， 然后再做第二轮pcr
一定要两轮纯化 |
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s******s
发帖数: 13035 | 25 直接测胶回收的PCR片段问题很多，我们这里facility基本上
就是告诉你别这么做。最好TA克隆了以后再测。
一定要测，我感觉要注意以下几点
1. UV照射时间尽量短。
2. Gel回收以后再PCR purification或者MinElute一遍，直接
gel extraction kit出来的东西非常脏。除非你QG/PE洗上十遍
八遍。
3. 测序引物可能缩进一点会好一些
off
Qiagen |
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n******d
发帖数: 680 | 26 没有觉得阿，上周刚在楼下的facility测了两个PCR片段，一个700bp一个450bp，单引
物测序，结果都非常不错的阿。
我只用了Qiagen的kit做了一次胶回收纯化，然后用30 ul的dH2O洗脱，最后用乙醇浓缩
了一下下。因为我这里的测序的要求是，PCR产物浓度应该达到10ng/ul。 |
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H*******i
发帖数: 196 | 27 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题，还没遇到第二次PCR做不出来的。
。 |
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s*******s
发帖数: 132 | 28 酵母壁太厚，没法像E coli那样方便的colony PCR，估计至少要zymolase之类的消化一
下细胞壁
我个人一般是先拿kit提genomic DNA，这样比较保险。另外，个人经验，kit提出来的
可能会过浓，PCR的时候多用几个模板浓度，比如1，1/4，1/20，1/100 |
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s*******s
发帖数: 132 | 29 酵母壁太厚，没法像E coli那样方便的colony PCR，估计至少要zymolase之类的消化一
下细胞壁
我个人一般是先拿kit提genomic DNA，这样比较保险。另外，个人经验，kit提出来的
可能会过浓，PCR的时候多用几个模板浓度，比如1，1/4，1/20，1/100 |
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A******y
发帖数: 2041 | 30 If you use CFX 96 and got well to well variation, you should call bio-rad.
It is still one of the best out there. SYBR green are expensive. All the
RT-PCR reagent are expensive. Tell me which brand sells significantly
cheaper that works. Quanta is more expensive.
PS. I have been using RT-PCR since the beginning of the technology. |
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t**********8
发帖数: 223 | 32 最近做了几十个q-pcr，是用actin做内参。今天老板email给我说，他朋友说必须要用
ERCC spike-in做internal control才准确。现在大家做q-pcr都用ERCC spike-in了吗
？ |
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H*******i
发帖数: 196 | 33 用premier看不出那段会有什么问题。如果实在弄不出来就换个酶，比测试优化条件容
易多了。 Annealing和酶有关，我自己设计的时候引物TM一般都是65+,实际60-
65Annealing，也用过72。没啥大问题，P不出来一般都和模板有关，比如开始部分有个
terminator，超长的reverse complementary序列之类的。
另外我所有PCR都加了5%DMSO，这个有些公司推荐PCR组分里就有。 |
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d****h
发帖数: 46 | 35 没什么特殊protocol
第一步PCR后跑胶确定产物的质和量
质量好的话，可以不用纯化片段，DpnI digestion后直接作为模板
两个片段大慨1：1加入
多加些第一步PCR产物, 减少循环数（<20) |
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d**********9
发帖数: 981 | 37 那在一个PCR后，都不要将两个PCR产物放在一起作一次延伸？ |
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y********8
发帖数: 23 | 38 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起， 结果除了7k的目的片段之外，始终有
一条很强的4k左右的片段，想请教如何去除4k的片段，我不想做gel cutting和再次PCR
，怕引入mutations.
谢谢！！！ |
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b******k
发帖数: 1874 | 39 可以试试直接，连接，转化ecoli：
1 如果那4k的杂带没有对应的霉切位点，不会被链接。
2 如果转化了，有可能通过plasmid 电泳区分出来。
3 再不济，用菌落pcr筛选
PCR |
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b*********b
发帖数: 64 | 40 gel purification没那么容易引入mutation的，只要你不用紫外使命的照。我做过的克
隆多到没法数，从来都做gel purification，2k以下的片段，我最多挑4个克隆去测序
，大部分时候是100%正确，还从来没遇到拿不到正确克隆的时候，而且做了gel
purification，会给你后来的几步省去很多麻烦。
照胶的时候放个尺子在你的gel旁边，这样你就知道该往哪割了。我用紫外最多不超过
30s。你要担心胶纯化后7k片段浓度太低，同时做几管PCR，全部跑胶。
PCR |
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H*******i
发帖数: 196 | 41 各种方法都有优缺点，合理使用才是关键
如果要构建大量同系列克隆，酶切连接自然有优势（至少不用成天买primer），而且在
最后成环一步，酶切连接也是最robust的方法之一（有时二级结构对Gibson/Slic有点
影响，尤其是一律50°C的反应，基于PCR和recombination的问题就更多了。） Scar
只要用overlapping PCR解决就是了。
当然完全构建一个全新的，一次性的需要大量不同片段的东西，自然Gibson assembly
类方法有优势（做特别大的片段也有优势）
Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease
Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase
加上polymerase
就两三刀吧。
Slic一样片段，只用T4 DNApolymerase，两片段效率大概低两个数量级。
另外LZ你需不需要额外纯化是根据你片段性质来得，你7kb的是啥？ insert得话必须
纯化，无论什么... 阅读全帖 |
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y******s
发帖数: 92 | 42 PCR效率问题。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下，试不出来才怪。
silencing.
认。 |
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b*****n
发帖数: 55 | 43 请问是否有合成的cDNA的kit，其产物可用于mir 和通常的 mRNA 的qRT-PCR？如果有是
哪一家公司的什么kit? 还是必须分别合成cDNA，以用于不同mir 或 mRNA 的qRT-PCR？
谢谢！！！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 pls check a couple of years ago here similar post:
juzbox
2011-05-26 11:38:29
来自: 95.91.
4th floor
完全同意！
Biorad应该是性价比最好的，稳定性兼容性也不错。LC480使用超过2年之后问题接踵而
来，而且维护费用离奇的高，我们这LAMP UNIT接连坏了2次，维修报价直接让人吐血。
试剂耗材更不用说了，好在用的多，给打了非常大的折扣，但一般实验室如果不是当水
喝的话估计拿不到这个价格。板子我们后来用从另一个公司订制的，价格便宜一大半，
而且更好用。结果roche一听说我们要换板子，立马就表态可以match这个价格（之前怎
么谈都只同意给7折）。
其实实验室用过biorad的都觉得好，不过奇怪的是，一个非常重要的检测，只用用
LC480才能得到稳定的结果，biorad和ABI都不行（也许是相对老一点的机器的缘故），
所以老板就只认LC。当然，除了试剂耗材和维护费用，LC480也算得上好机器了
contract
括2台仪器加96well和384的探测头各一个（3年前的价格）。
c... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 45 rt
有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
是不是8kb太长了？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 46 哦。这样的啊。
另外，实在不行的话，你还是改用overlapping PCR吧。随便从vector 上找两个single
restriction site把你要改的地方包含在里面，然后用overlapping PCR把相关片段给
P出来，然后替换进去就可以了。 |
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C**S
发帖数: 522 | 47 1：没什么解释，就是pcr或者transform的时候突变了。
2：我这儿测序，精确度能到800到1000bp，所以2.5k三个primer就覆盖了。涉及到PCR
的克隆，测序还是需要的，不一定哪里就产生一个突变。
digestion |
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H*******i
发帖数: 196 | 48 1.没有突变有两种可能，一种是dpn1处理不完全，第二（某些设计中）如果你的引物5
’可以匹配一段序列，但是3'是突变，那么似乎高保真酶可以把3’切掉，完成PCR，另
外从smear可以看出，你PCR进行得并不好，如果目标片段之中有什么重复序列相似序列
，出现deletion也是很可能的。 我见到smear最多的就是multimer,如果你引物设计如
果做得和cpec最后一步一样，smear可能性非常高
2.pfu按照NEB说法只有6x的保真性，所以肯定要测序（尤其是引物部分，2.5K用不了10
对引物），克隆做多了 phusion Q5突变都是一堆一堆的。
digestion |
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o*******n
发帖数: 76 | 50 请问这儿有人做过gender PCR吗？最近在做，经常有contamination的问题，试剂都换
过了也没用，PCR也是在hood里做的，愁啊！ |
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