C*******e
发帖数: 4348 | 1 ....不是纠结这个测不测序的问题
不知道是不是我原帖没有写清楚
我还提了细菌X的endogenous plasmid，有这个origin的
提的质粒跑胶确认过
还是一样P不出来
或者说P完了以后只有加样孔里有东西
不加酶的control跑胶加样孔里干净的
同样的master mix PCR别的东西（primer template不一样）则跑胶正常，加样孔没东
西，扩
增条带在它该在的地方
有没有遇到过这种情况的？ |
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A******y
发帖数: 2041 | 2 There is no way RT-PCR will match Western exactly... |
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n***w
发帖数: 2405 | 3 嗯。我觉得你说得对。
你们看这样写怎么样？我觉得说得是不是有点刻薄。。。
Hi, Dr. Xu,
Today I read through your paper titled "Inhibition of JAK2/STAT3-mediated
VEGF Upregulation under High Glucose Conditions by PEDF through a
Mitochondrial ROS Pathway In Vitro" which has been published in
Investigative Ophthalmology & Visual Science, January 2010.
I found the two figures from Fig 7, which are from ELISA and RT-PCR,
respectively, are exactly the same, except for the replacement of names of x
- and y- axes.
I have no offense to you t |
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h********n
发帖数: 4079 | 4 我仔细看了这篇文章的图, 有好几个图, PCR和protein结果看上去一样的, 不过仔细一看, 确实略有不同, bar的高度或者error bar不同.
但我的直觉告诉我, 这个应该是作假. |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 Did you transfect your cell with a plasmid?
In such a case, you need to treat the RNA sample carefully with DNaseI to
remove all the plasmid DNAs. Otherwise you are just doing PCR using the
plasmid as template |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 Depending on your purification methods, but I recommend the
RNase-free DNase kit from Qiagne.
It is CRITICAL to remove the Plasmid DNA, otherwise you are just doing PCR
on your plasmid, not the cDNA. Most RNA purification kit are designed to
remove genomic DNA but they are NOT designed to remove plasmid DNA,
therefore you have to do it yourself.
The reason you don't see the S16 can be due to:
1. you don't add enough cDNA template (plasmid DNA has strong asorption and
will mislead you to think yo |
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L**********r
发帖数: 143 | 7 Want to get some data before setting up my own real time qPCR; are there any
labs or core facilities provide contract service of RT-PCR? |
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g*******8
发帖数: 6 | 8 老板让我学做 RealTime pcr去quantify some sample dna。 但我做了好几次，
standard 四个点总不能连成很好一条线。我现在非常frustrated. 不知是standard 做
的不好还是加sample前mix的不好。无论怎样我猜都是mix的问题。我是这样做的： add
3ul standard into 27ul H2O to make 10 fold dilution 。 then pipett up and
down for 20 times to mix it and use it to make another 10 fold dilution. I
am not sure if I mixed very well before I make another 10 fold dilution.
Is vetex better? I am afraid vetex will break dna. So I tried not to use
vetex. If I can use vetex, which setting I shoul |
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M****e
发帖数: 178 | 9 我开始比较恐惧做realtime PCR，因为标准曲线总是不好，也不知为什么，其实自己
benchwork已有很多年的经验了。自从我们实验室在一年多以前，买了台新的Roche
LightCycler480，我每次做的R square都基本上是1。所以我觉得有时仪器挺关键的。
还有，我觉得最好是一次一个tip。同样的sample连续加同样的体积，最好每次都换tip
.我有时为了省两个tip，R square立即下降。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 No need to optimize.
USe a high fidelity enzyme to do a firdt run, purify the product with the
exact size from gel, use it as template to run another round of PCR.
vector |
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n***w
发帖数: 2405 | 11 谢谢ls各位。
关于用前一轮产物做模版，我之前跑过几次，发现目的条带不够强。。。
总觉得，因为前一轮pcr没有纯化，里面东西很多。。。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 12 我大学的时候看了中文翻译的PCR史话，惊叹于莫里斯的天才
这个人才华横溢，但是离经叛道
他的天才之处在于想到了别人不敢想的，但是动手能力显然很土
如果不是公司而是学校等科研机构，他肯定被吞噬了，死在tenure制度之下了
Khorana |
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r**a
发帖数: 121 | 13 我们从别的实验室得到一个果蝇的mutant（通过imprecise excision of P element)
缺失了一个片断，包括一个整个基因和它下游基因的部分
然后，我们要确定它的具体序列
我们在这个缺失片断的上游和下游都分别设计了引物对
确定了大概的缺失部分
然后，设计了几对横跨这个片断的引物
但是，就是怎么也拉不下来这个片断（片断理论上在1kb-5kb之间）
各位有什么经验或者建议
是不是有可能是有什么特殊的结构在这个之间，阻止了扩增？
还是有别的原因？
怎么改进PCR条件来得到这个片断呢？
谢谢了！ |
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l**l
发帖数: 458 | 14 XDJM做RT-PCR有没有在合成完cDNA,测cDNA浓度的如果浓度有差别怎么办?谢谢! |
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h******y
发帖数: 1374 | 15 请教如何在PCR的引物的设计中能够规避splice variants的问题？ |
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c*********u
发帖数: 3128 | 16 就是那种剪了尾巴或耳朵，蛋白酶K随便消化几个小时就可以直接PCR的kit。
用来做genotyping
我以前没做过这方面。
谢谢各位了。 |
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c*********u
发帖数: 3128 | 17 No, I mean the PCR kit for genotyping. this kit can be used for the dirty
and unpurified DNA sample. |
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w*e
发帖数: 740 | 18 HEAT SHOT的方法，
尾巴加热半个小时就可以做PCR了
5块钱的试剂用1年 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 可以，我扩过，12kb
对细菌基因组的质量要求比较高
我是自己提的
跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
一次成功
就是筛没有error的克隆费了点劲 |
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h**********r
发帖数: 671 | 22 筛没有error的克隆，这个有啥技巧？
LA PCR kit （Long&Accurate）的保真度有多高？
多谢！ |
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V**F
发帖数: 164 | 23 想clone一段 23kb genomic region.
请推荐一个extra long PCR kit.
谢谢！ |
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r********y
发帖数: 18 | 25 有个问题请教大家，关于real-time PCR，由于starting materials 比较少（只有大约5000 cells），很难在reverse transcription 之前通过RNA浓度进行校正，所以我们将所以的RNA 都用了逆转录了，结果内参ct值相差很大（wt 和KO之间相差有3个cycle，不过都还低于30 个cycle）。 不知道这样的结果出来之后用delta delta Ct方法来分析是否可信？
恳请大家不吝赐教 |
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c******r
发帖数: 3778 | 26 我想应该是可以的。
如果target比较多，每次一个个run standard curve确实很麻烦，也很浪费。
如果不得不comprimise， 我想能不能每个target先run几遍standard curve，make
sure the amplification efficiency varies in an acceptable range。这个可以直
接得出efficiency的average和std。这样以后run的时候不再run target的standard
curve，而是只run一个internal control的standard curve。通过refer你前面的
standard curve中的internal control来确定你的PCR run at optimal efficiency。
而且make sure你的target的Ct fall into你的linear range。
反正就是想点办法吧，你觉得这样行不行？
这种事情每人情况不一样，反正需要自己设计实验让它能够reasonablely convincing
就好了。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 27 S16含量那么高，只有mRNA的质量相当差的时候才会做不出来。
找个less abundant的基因试试你的RT-PCR. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 28 我们实验室用prepacked的sterile PCR tubes和pipette tips，不autoclave。
但是我在以前的实验室也用过autoclave的，没有问题。
理论上来说autoclave是可能成为contamination source的，但是我感觉概率不大。除
非你已经排除了其他可能的污染源，才值得考虑autoclave的问题。 |
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i*S
发帖数: 175 | 29 我做realtime PCR，每个基因设了三个一组的无模板空白对照，发现有的对照会在循环
末阶段扩增。通过threshold时，大概是在三十多的Ct吧。三个replicates的Ct值十分
接近。
这应该是非特异扩增吧，但是我查看了下熔解曲线，发现峰值也固定，80度，将近同时
测定的模板正常熔解温度了（86）。既然峰值都固定，还可能是“非特异”吗。
想问下这样大概是什么原因？有什么手段可以消除呢？提高退火？可我现在的退火温度
只比最低引物Tm低一度多点。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 30 是引物二聚体
以前做real time PCR经常碰到
如何消除没试过 |
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e***o
发帖数: 344 | 31 目前在做一个实验，要求检测到0.01 pg 以下的DNA模板. 现在我在做巢式pcr,大概能
检测到0.01 pg （1000 copy）.但是不稳定。不知道各位大虾有什么好的意见没有。谢
谢。 |
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e***o
发帖数: 344 | 32 谢谢，回复。不知你pcr的时候有什么技巧。
对了忘了说一声，我的实验要求高保真。所以一些活性超强的酶不敢用。也不敢多加
mg2+, dmso之类的东西。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 33 你这个pcr做来干嘛用的？检测HIV？还是克隆什么东西？ |
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e***o
发帖数: 344 | 34 我需要transfect一些barcode，然后是用来测single barcode序列的。老伴没做过
bench work，天天说能检测到一个copy。不知道有没有法稳定到10copy去。你检测到10
个copy的PCR条件是什么. |
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g*****n
发帖数: 241 | 35 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
火温度，结果要么是很多带，要么没有。
请问大家有没有什么建议？
谢谢！ |
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h****6
发帖数: 229 | 36 Can you synthesize the first 60 bp and make changes to the sequence to
change the GC/AT ratio for PCR? |
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W****C
发帖数: 1937 | 37 RT 引物 是一个hairpin的大概70碱基的DNA,末端单链大概有10个和mir匹配， 这样RT
就会以mir为模板再加10个（20－10）碱基到引物上。 PCR的时候引物针对这个新合成
的大概80的DNA特异就可以啦 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 39 我给出的不是紧挨着测序引物的部分
测序是从insert上下游比较远的地方（>60 bp）开始测的
所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC，现在只有GCCGGCC，所以
不切（已经试
验过，而且酶是好的，另外也做过实验跟甲基化没有任何关系） |
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l*****a
发帖数: 1431 | 40 对，是5’端少的，linker没了。作PCR看着是正确的条带，回收后作连接，怎么也连不
上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。 |
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h****k
发帖数: 182 | 41 从cDNA中pcr克隆基因，如果5'端翻译的起始密码子有多个可能，如何设计引物或者有
什么好方法可以解决这个问题？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 42 用gradient PCR去摸退火温度的条件
我经常这么干
另外如果68度扩增不出来，换成72度试试看 |
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S*******m
发帖数: 34 | 43 有一个事情没注意到.如果你的cDNA已经在载体上说明已经是双链了.镁离子应该同普通
PCR一样,用
1.5. 3mM是用于扩增作完RT之后的单链cDNA的. |
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n***w
发帖数: 2405 | 44 今天多加了点模版，然后用pfu和taq混合，3:1，pcr，条件没变，然后出了条带，然后
回收了。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 45 大家真有钱
我们都是自己表达的pfu
不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的 |
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s******r
发帖数: 2876 | 46 帖个纯化的protocol吧。
大家真有钱
我们都是自己表达的pfu
不过用来做whole plasmid pcr for site directed mutagenesis 还是杠杠的 |
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n***w
发帖数: 2405 | 47 上次买的phusion来了，然后用pfu+taq弄出来的做模版用phusion做，相当impressive
！！！！
回收率也不错，明天直接把pcr产物送过去测序看有没有mutation。估计周五就知道结
果了，大家也就别争拉。
谢谢各位的帮助。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 48 前几次一直长不出colony，换了一个ligase，这次transformation后平板上长得满满趴
趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl，长得比有insert的还要满。
很高兴。挑了18个colony做PCR check，结果出来傻眼了，什么都没有，光marker那一
条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊？多谢多谢！ |
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v***a
发帖数: 1242 | 49 多谢了！刚才查了一下，说colony长得异乎寻常的多有可能是RE incompletely cut。
想了想，可能是我的enzyme的缘故，我用的其中之一是SalI，网上有人提到这个enzyme
has problem with PCR product，所以打算重新设计primer。谢谢大家的帮助，也希
望托大家的福这次可以成功。 |
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i*****i
发帖数: 30 | 50 首先问楼主
1.PCR出来有条带吗
2.是双酶切吗，单salI必须去磷酸化，引物有保护碱基吗 |
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