s******9
发帖数: 283 | 1 total mRNA for cell-free translation is a bad idea, unless you have single-
molecule detection sensitivity. You have to fish out the cDNA, add a strong
promoter and synthesize a large amount of mRNAs for the translation if you
can only do western. |
|
W*****o
发帖数: 1780 | 2 现在检查mRNA integrity的办法是不是都是通过rRNA的？（28S:18S或者RIN).有没有办
法不通过rRNA直接检测mRNA是否降解的办法？谢谢！ |
|
c*******0
发帖数: 190 | 3 最近有一篇关于BRCA1 mRNA检测的paper被打回来，reviewer说我们的实验把mRNA在细
胞内的结构想得过于简单，它们往往都有二级或更高级的结构。虽然这个基因比较大，
但我们检测的序列目标大约就在4000bp左右，如何设计一个实验验证这段区域是否有高
级非线性结构啊？或者有什么推荐的数据库来预测吗？谢谢大家先。 |
|
b*****n
发帖数: 55 | 4 请问是否有合成的cDNA的kit，其产物可用于mir 和通常的 mRNA 的qRT-PCR？如果有是
哪一家公司的什么kit? 还是必须分别合成cDNA，以用于不同mir 或 mRNA 的qRT-PCR？
谢谢！！！ |
|
l****1
发帖数: 168 | 5 We need a 10-mer DNA sequence which won't hybridize with any human mRNA
sequence. But I design a few and always can find it 100% match in human mRNA
database. Can anyone help me on this? Thanks |
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 首先，确认你的WB没有问题。这个对于新手是常出的问题。
第二，有些蛋白的mRNA是过量的，平时只有少量的会被翻译，其他的放着备用，在
stress response 或者细胞分裂的时候才会用上。所以你在平时来检测蛋白含量是看不
出来区别的。如果要确认这些问题，一个最简单的方法是用serum starvation --> add
back serum 的方式来激发细胞来使用大部分mRNA |
|
g*****n
发帖数: 241 | 7 线虫里有没有non polyadenylated mRNA呢？
其他生物的histone的mRNA是没有的，但线虫的histone貌似也有polyA
谢谢 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 8 lncRNA和mRNA之间，好像还没找到像miRNA和mRNA之间那么简单的关系吧。 |
|
l*********i
发帖数: 332 | 9 btw, E Schuman and MS wrote a new review about mRNA and memory stuff on the
newest cell,
you may check it out. |
|
c******d
发帖数: 306 | 10 did ur use mRNA seq for gene expression investigation? have u ever try to
use SNP also. seems it is biased, because all SNPs come from coding region.
make |
|
n**********1
发帖数: 251 | 11 最近要做mRNA-Protein co-Immunoprecipitation，对于大致的步骤和原理大概知道
，不知道有没有相应的试剂盒，还有在沉淀下来后，为什么要加入yeast tRNA，或者
linear acrylamide 和 glycogen，据说作用是carriers，我不太知道具体是什么作用
？ |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 12 Ambion
他家有mRNA enrichment的kit
自己去看就好啦 |
|
a*****g
发帖数: 543 | 13 1） NanoString吧
2）assume mRNA-cDNA linear,用your favorite gene plasmid (算molecular weight,
molecule concentration) 做serial dilution, qRT-PCR. |
|
c****1
发帖数: 1095 | 14 测cDNA的拷贝数是没有问题的，可以用一系列已知拷贝数的DNA为摸版作标准曲线。现
在问题的关键是，能否用cDNA的拷贝数代替mRNA的拷贝数。根本的问题是：新合成的
cDNA会主动跟RNA解链么？如果可以，RNA可以再次作为摸版合成新的cDNA。这样问题就
出现了。 |
|
l******u
发帖数: 936 | 15 是的, 其实RT的过程问题很大的, 酶的作用以后都不能真实反应初始的mRNA情况了.
所以研究transcript, 以后的趋势是直接 digital read out.
nano string 已经可以做到了啊, 只不过这个东西太贵.
直接的 RNA seq 现在也还没开始普及. |
|
|
z*t
发帖数: 863 | 17 miRNA的两个效应翻译抑制和mRNA降解，植物以直接降解为主，虽然大家在哺乳动物倾向翻译抑制，我的印象中没人很严格的set up实验证明哺乳动物里哪个是主导，这篇文章算是一个基因组水平的解惑吧。 |
|
w******y
发帖数: 8040 | 18 早在2004年， Merck@Seattle就发表了mRNA降解在mammalian里是非常普遍的
Bartel这片能上nature我觉得很奇怪
倾向翻译抑制，我的印象中没人很严格的set up实验证明哺乳动物里哪个是主导，这篇
文章算是一个基因组水平的解惑吧。 |
|
a***e
发帖数: 1010 | 19 the main conclusion of this paper is that " that destabilization of target
mRNAs is the predominant reason for reduced protein output"
--------------------
Bartel gave the talk in Keystone symposium in January and shocked everyone.
However, some people are concerning that the conclusion based on cell lines
may not represent the real mechanism in vivo. For example, Victor said lin-
4 does most in translation control. So does Gary with let-7. |
|
t*d
发帖数: 1290 | 20 因为 Bartel 是这个领域的权威。他在 2004 发了两篇reviews，一篇在 CELL， 一篇
在 Nature Reviews Genetics。在两篇 reviews 他都倾向于 mammalian miRNAs 主要
抑制翻译的观点。但是miRNA的大头也基本倾向这个观点。Rosetta 2004 的文章没有提
供直接的证据证明那些下调的 mRNAs 是 miR-1和miR-124 直接targets。所以 Rosetta
的文章动摇了军心，但是还没有颠覆大家伙先入为主的观念。 |
|
l******i
发帖数: 14 | 21 我太爱这篇paper了，当时我们这边一个教授的实验室就是有这么一个争论，一个中国
人认为是mRNA level,而另外一个印度薄厚认为是translation level,结果这位老板信
了后者，因为这位中国人脾气火爆，然后惹怒了这位教授，结果这位东欧的教授把那位
中国学生以作假的名义fire掉了。
现在bartel的实验室由一位中国学生做出相反的结果，真是让人大快人心啊，呵呵。我
希望篇paper能够被重复出来。 |
|
t*d
发帖数: 1290 | 22 下一个要证明的是：
mammalian miRNAs bind to both coding region and 3'UTR with equal chances to guide mRNA
degradation or block of translation.
从此以后，世界就清静了。 |
|
a*****g
发帖数: 543 | 23 Greg Hannon has some data of the binding,
not only coding, but also 5' UTR....
to guide mRNA |
|
s******y
发帖数: 28562 | 24 难道不是这样的么？
我不在具体作这个field, 可是我觉得，凭什么人家一定要结合到3'-UTR?
爱那那，有什么不行的？
to guide mRNA |
|
n******7
发帖数: 12463 | 25 从文献和我们以前的分析来看，虽然cds也能坚定到一些target，但是信号比3'utr差太
多了
至于5utr 我觉得问题在于太短，很多mrna就没有
一年多没关注这个了，欢迎指正 |
|
x*****d
发帖数: 704 | 26 最近老板让偶从Fibroblast里面分离mRNA. 试过了Ambion的microPolyA和invitrogen的
ribominus,感觉效率都不是特别好. 尤其是ribominus,用bioanalyzer检查感觉tRNA没
有除掉. 各位大牛有没有什么好推荐的? |
|
e*****t
发帖数: 642 | 27 知道一个mRNA snp和它在genome上的位置。如何知道编码的蛋白突变位点？genome
browser，ensembl或者ncbi应该都行，但是看了半天没看出来。高手帮帮忙 |
|
l***7
发帖数: 50 | 28 Hello, everyone, the gene I am working on has protein expression as detected
by western blot, but its mRNA in the same type of cells is undetectable by
real-time PCR. Do you know how to explain this? Thanks very much! |
|
Z**********g
发帖数: 222 | 29 搞一个表达该基因的阳性细胞和不表达该基因的阴性细胞作为对照,确定一下PCR或
western是否出问题.另外,你的样品是否经过处理(如药物),比方说,可能该处理抑制了
mRNA表达,但该蛋白比较稳定,半衰期长. |
|
E****A
发帖数: 184 | 30 多谢！
RT-PCR和Northern blot验证了两条mRNA的存在。
看了楼上的PNAS文章，说uORFs correlate with significantly
reduced protein expression of the downstream ORF.
不知first exon的uORF会不会对alternative first exon的ORF产生啥影响或抑制作用
呢？ |
|
F*****e
发帖数: 182 | 31 genotype最快也得2-3个小时吧，把胚胎的尾巴拿来用NaOH煮一下，Tris-HCl中和以后
离心取上清
直接做PCR，PCR run一个半小时，跑胶20min。
今天听说Ambion也有一个RNAlater solution，把tissue放在里面很稳定，据说很牛。
我们就是想看看mutant里面哪些基因的RNA水平有变化，然后跟phenotype联系起来好找
mechanism
啊。
做library的话facility用的是illumina mRNA sequencing sample preparation kit，
两天完成library，似乎不用花太大力气。有没有做过的朋友？ |
|
D******t
发帖数: 79 | 32 RNAlater works good for me, although some people started to argue against it
.
For mRNA Deep sequencing, I extracted the 200bp band and purify the band
myself. It works good. |
|
b**********8
发帖数: 349 | 33 继续问，如果是通过3'/5' -UTR影响mRNA 稳定性，可以通过luciferase活性进行鉴定
。那如果是通过ORF区域呢，可以通过什么实验技术来检测？ |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 34 除了5' RACE还可以做primer extension啊
不过就是要用P32
如果同时又好几个mRNA TSS的话
结果上也会看到几个不同大小的片段
然后根据信号的强弱可以知道哪个是主要的TSS
对于翻译起始位点
不能光看ATG吧
还要结合RBS看 |
|
K**4
发帖数: 1015 | 35 For 5'RACE, choose the longest one. Short ones may be degenerated mRNA,
although the longest one is most likely degenerated too.
ATGATGATG is a way to start an effective translation.
RACE |
|
m***o
发帖数: 272 | 36 Thanks, whitesand.
1. We are thinking of doing that way. But most plasmid has a strong promoter
, I am guessing whenever they meet ATG they all will transcribe. The other
possible is we clone this gene's own promoter and mutate each of the 3 ATG
to see. There will be a lot of work and now I do not have any idea how long
the promoter will be.
2. If my GSP recoginze a sequence in the reverse orientation, why it
transcript the complete exon not part of it?
I am thinking of what wenqian said because... 阅读全帖 |
|
m***o
发帖数: 272 | 37 western blot上在别的组织上有个短的条带在WT上有，但是在knockout上就消失，别的
非特异条带没有变化。但是我现在觉得这个我找到的shortform不是看到的那个条带，
因为根据这个序列推测蛋白要小很多。
现在我比较确定这个shortform mRNA 的表达在我做的这个组织上很高，因为RT用这个
短的5UTR为forward primer（全长没有这个序列），可以看到很亮的条带，但是别的组
织没有。
我现在也有些不知该怎么往下做，因为抗体不是很好，很多非特异条带。 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 38 推荐Partek Genomics Suite，个人认为是目前最好的高通量数据分析软件：跨平台，
能够整合分析各类芯片及NGS数据，下游扩展也很丰富。不过软件卖的比较贵。
如果你对bioinformatics及其相关软件不是很熟悉，那么不建议从原始数据开始处理。
通常一般从公司或者core facility拿到processed data之后，那么可以尝试使用一些
现成的webserver，比如：
MicroRNA and mRNA integrated analysis (MMIA): a web tool for examining
biological functions of microRNA expression
Nucl. Acids Res. (2009) 37 (suppl 2): W356-W362.
http://129.79.244.122/~MMIA/
.
!! |
|
c****e
发帖数: 188 | 39 I am learning MMIA now. Thanks for the information.
Is cytospace a good tool to do this too?
Besides microRNA and mRNA, I also have 450K DNA methylation array data from the
same matched samples. Will Partek Genomics Suite integrate all of the data together?
Thanks! |
|
e****p
发帖数: 354 | 40 在有些细胞中，为什么只有mRNA表达而没有蛋白表达呢？有没有什么文献a? |
|
s******y
发帖数: 28562 | 41 啊。。。情况很多啊，可能性也很多啊
1. 该mRNA 的表达被抑制了，比方说被miRNA，或者某些蛋白（比方说
zipcode binding protein) 抑制了
2。蛋白表达后迅速被降解 |
|
y******8
发帖数: 1764 | 42 Are you sure the mRNA are actively translated? |
|
s******s
发帖数: 13035 | 43 你这个问题太搞了，都说了mRNA-seq了，还指望啥ncRNA?
seq本身无所谓啥都行，关键你library怎么做而已 |
|
e**o
发帖数: 345 | 44 Translational regulation
看了一些mrna转运的reviews。怎么都没提ribosome。 |
|
r***e
发帖数: 2539 | 45 当然可能，极端的例子，载体的cDNA突变了没表达，但mRNA还在啊。 |
|
v***a
发帖数: 1242 | 46 没有。弱弱地问，kozak是啥？
是的，我的对照mRNA level看起来不高。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 47 LZ为了过份表达 选的promoter inserted xxxxx bases upstream of the Start codon may affect the Kozak
sequence or rbs.
then a nonsense mutation is a mutation that causes a premature stop,
resulting in a truncated or nonfunctional protein
NB: if it is my misunderstood please let me know it.
回复]
>发信人: vonda (Vonda), 信区: Biology
标 题: Re: 用qPCR检测mRNA，高1000倍，却看不到蛋白
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 31 19:01:56 2012, 美东)
天……我overexpress的是一个extensively studied的蛋白。。。没有文献报导过它不
稳定。那是阅读框错了？但是overexpress后，细胞的一些signaling pathway... 阅读全帖 |
|
e*******c
发帖数: 1479 | 48 我发现自己做的蛋白可能受到cap protein eIF4E or eIF4G的调控， 理论上来说这个
蛋白的mRNA应存在5'的TOP结构，就是5-15个聚嘧啶之类的，
但具体如何判断呢? 是以atg为起始密码往上游算起吗？多少的范围呢？
请各位大拿赐教。谢谢 |
|
e*******c
发帖数: 1479 | 49 哥们, 能否详细说说, 我觉得是否应该做核糖体分级分离, 然后对分离的mRNA进行RT-
PCR鉴定， 然后再作 NMR分析？
但是如何分析NMR结果？ |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 50 >能否详细说说, 我觉得是否应该做核糖体分级分离, 然后对分离的mRNA进行RT-
Yes, next steps are:
+1 Protein production
+2 Structure determination by X-ray synchrotron radiation,
Protocol please refer:
//uit.no/publikum/prosjekter/prosjekt?p_document_id=228973
----
然后再作 NMR分析interaction between cap and elF4E/G
if you already read 1H NMR spectra chemical shift value before
you can understand below PhD thesis:
//info.ifpan.edu.pl/~annan/dane/zasob/doktorat.pdf
its. Chapter 3. 7. 2 NMR Data Analysis at 298K
Equations 3.64 and 3.65
... 阅读全帖 |
|
