m********2
发帖数: 317 | 1 我，生物男，博后3年，有不错的文章，CNS 一篇，JCI一篇，目前正在做第三篇，不会
低于cancer cell。明年3月份应该能够投出去。都是第一作者。
现在非常想做两个knockin小鼠，是我在试验中发现的，目前还没有人做过。
我想去公司做， 但是我在国内没有经费，没有办法去公司做。我想现在去公司做，等
到我明年年底回去的时候，就直接可以用小鼠了。
请问大家国内高校（主要是北清NIBS中科院，因为我主要想去这几个单位）有没有这样
的项目，目前我只需要20-30万元。
谢谢 |
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n****3
发帖数: 543 | 2 想利用polyA trap 做基因打靶：long arm-PGK-neo-ires-EGFPFlpe-SD-short arm ，
target 细胞以前整合有Frt-stop-Frt RFP表达盒，平时不表达RFP. 如果转染FLPE表达
质粒，可以切掉stop片段而表达红色萤光。现在想利用polyA trap打靶方法将PGK-neo-
ires-EGFPFlpe－SD片段knockin到目的基因的内含子内. 如果打靶成功，该细胞将可以
表达双荧光，我想尽量减少我筛选打靶事件的工作
转入的片段尽管没有polyA,但启动子和融合蛋白的编码区是完整的，
questions: 那随机整合或瞬时转染会不会也能转录出mRNA(缺少polyA)？如能转录
，这个缺失polyA的mRNA会不会翻译出有功能的EGFPFlpe融合蛋白，并有可能激活红色
荧光蛋白的表达呢？ |
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T****u
发帖数: 424 | 4 Then that's knockin cell line to a specific position.
Cas9 and TALEN will help. |
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Z******5
发帖数: 435 | 5 这两种荧光蛋白的检测机器我们动物房都有
要在C57老鼠里过表达一个基因，rtTA诱导的，然后和手头的MMTV-Cre老鼠杂交实现乳
腺组织特异性表达，看老鼠自发乳腺癌是否会增多。
现在想在基因后面加一个IRES-EGFP，或者IRES-Luciferase， 用来指示目的基因的过
表达情况。不知道加哪个好。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 6 听说EGFP观察更容易，不需要加底物。但问题是需要激发光，老鼠的自发荧光会有干扰
。虽然EGFP灵敏度比Luciferase高，但是有本底的干扰导致实际灵敏度还不如
Luciferase。
Luciferase好处是可以定量，不受自发荧光干扰。但是观察前需要腹腔或者血液注射底
物。据说灵敏度可以达到100个细胞，然后随着距离体表的深度每增加0.5cm，检测的灵
敏度升高一个数量级的细胞数。
两者可以说各有优缺点。总体感觉luciferase可能更好。但是发表出来的论文中貌似转
基因的多数都是EGFP标记，而luciferase大多是用来标记打入老鼠的外源肿瘤细胞。
这方面没啥经验，请有经验的朋友给个建议。 |
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q******g
发帖数: 3858 | 7 我也不太懂，随便说一下。
我想你需要观察动物的乳腺，看该蛋白是否有表达。
如果你有红色的荧光蛋白，mCherry, Tomato之类的，肯定不存在自发荧光干扰得问题
。这应该是最好的选择。
但考虑到你看的自发乳腺癌，离表皮比较近， 或许干扰比较小。这你需要查下文献。
luciferase用于活体观察没有问题。但如果你想分离乳腺细胞，做流式细胞仪分析，可
能荧光蛋白更好。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 8 我们一般用EGFP-Luc fusion protein，效果非常好 |
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d****i
发帖数: 2346 | 9
太强了！有这个最好。如果没有，需要分离细胞或者tissue用GFP，需要活体动物水平
观察，建议用luciferase。 |
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r***z
发帖数: 19 | 10 你这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面还是插入到最后一个外显子
中？ |
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s******a
发帖数: 472 | 11 EGFP也可以定量吧，如果是过表达我想自发荧光应该不是问题吧。
同意楼上的EGFP-luc，双保险。 |
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l********e
发帖数: 415 | 12 crispr/cas9 mediated knockin repair
penetrated |
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s********r
发帖数: 312 | 13 一般是在你目的基因下游紧挨着放ires-gfp,加tag的话就不用ires |
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f*****f
发帖数: 195 | 14 谢谢。有个疑问，直接放ires-gfp或gfp，基因组序列一下增加了几百bp，不会导致可
变剪切吗？ |
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l********e
发帖数: 415 | 15 如果你放splicing acceptor site的话，的确会 ... |
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r***z
发帖数: 19 | 16 这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧，last exon -ires-eGFP-
ployA. |
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l***y
发帖数: 638 | 17 用2A吧，效率会比ires高，需要detele掉gene本来的stop codon【 在 rexhz (
rexhuang) 的大作中提到: 】 |
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r***z
发帖数: 19 | 18 如果我只是想加个 gfp 便于我观察这个基因是否表达，这样做行不行。 promoter ---
--- ATG+eGFP+first exon---- |
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s********x
发帖数: 472 | 19 插gfp当然没问题，这个我们领域做的多了。
可变剪切从来没听说过，就算有也很少。
需要注意的事gfp会不会影响蛋白功能。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 21 由于一直以来没有表达Cre的工具大鼠，所以可能会影响到cKO大鼠的应用，进而影响到
大鼠做为模式动物在医学研究中的应用。我们这几个月想先做一二十种Cre Knockin大
鼠。然而，虽然大鼠在神经生物学和心血管疾病方面比小鼠有优势（所以用途更广），
但我对这两个领域不是很了解。我知道这里卧虎藏龙，麻烦这些领域的朋友给提一些建
议，以便我们可以有些目标，并对要做的Cre大鼠排一个优先顺序。如果您的建议被采
纳，一旦你用得到，我们会优先免费提供，或是提供给你指定的在国内的科研朋友。感
谢大家的帮忙。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 22 感谢zhaohu, daihsh, muhe1985, sunnyday, rayxixi, sumo2009, andycai,
lotkaeuler11, dua，以及Neverthink和直接写email或私信给我的朋友们的建议。我已
经把各位的建议拷贝下来，这周会把这批cre大鼠定下来然后尽快开始。
大鼠虽然不象小鼠目前用得这么广泛，但在神经疾病和心血管疾病方面的用途还是很大
的。而且目前能做大鼠基因敲进和cKO的地方很少，我想对我们来讲市场也远远超过我
们的产能了。之所以选择从cre大鼠开始做起，主要原因是如果有人想做cKO大鼠，一定
会需要cre大鼠。如果只是为单个客户做cre大鼠的定制化服务，其他客户要想用同样的
cre大鼠，我们就没有办法提供了。所以干脆先做一批常用cre大鼠。因为还没有见到任
何通过Knockin方法得到cre大鼠的报道，所以我想如果我们先做出一批来，说不定会把
模式大鼠的应用带起来。
神经方面有朋友给列出了10多个非常有用的cre大鼠，应该可以马上开始了。心血管方
面我们在综合一下各位的建议，希望也做一些。
lotkaeuler11 提到兔子和猴子，... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 23 if Cre rabbit
two EU dot com are doing it now:
a dot com
PolyGene dot CH
has a fully functional production site for the establishment of transgenic
and knockout / knockin animals, such as mice, rats or rabbits. Those animal
models (of human diseases) are suitable for all kind of research areas, such
as cardiology, oncology, obesity, immunology, neurology, physiology, ageing
, etc.
generation of constitutive or conditional, inducible knock-out animals (
mouse and rabbit) applying Cre/lox technol... 阅读全帖 |
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j*b
发帖数: 341 | 24 不双筛是46%
如果不是promoter trap,用CRISPR做Knockin的效率是多少？
文章里用的可是人ESC。难度很大
不一定同源臂越长，重组越高。比如用BAC，200kb 直接做KO vector,效果很差 |
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D*a
发帖数: 6830 | 25 其实绝大部分cre都不是完全特异性的，总会在其他某些地方有点表达。比如brain的，
如果要神经marker，周围神经系统很可能少不了。
如果没有这方面的数据，那就只能看运气。如果有这方面的数据，那就要看你的课题，
会不会冲突。比如你研究brain 跟糖尿病 那么leak到胰腺去了肯定不行，但是如果
leak到肺什么的，那也无所谓。然后还有就是运气，如果你做knockin（就是把一条
allele替换成cre），那么大概是没啥意外，如果你是弄bac后面接cre做随机插入，那
么它自己从哪里leak，你还真控制不了，只能多做几个line挑一挑。 |
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B******w
发帖数: 1040 | 26 如果是knockin到基因组里面的呢，不是环状的 |
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d****7
发帖数: 109 | 27 我刚做ChIP的时候也遇到过这种情况，这种现象可能是factor specific
这样吧，你在跑ChIP的时候，再多跑一下两个样品：
(1) un-crosslinked whole cell extract
(2) crosslinked but un-sonicated chromatin
如果(1)都没有目的条带，证明抗体根本不识别蛋白，或者蛋白根本不表达。但是既然
你说是knockin tag，也许表达亮太低
如果(1)有带，(2)没有，说明蛋白的epitope可能被formadehyde毁掉了
如果(1) (2)都有带，超声后的input没有带，证明oversonication，把蛋白给毁了，我
最近就遇到这种情况，都是input，超声前能检测到带，超声后就没了。。。。
还有，煮10分钟足以，30分钟有点过 |
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t******k
发帖数: 5617 | 30 直接ROSA 26A位点knock in 做出flox mice，然后再和tetrocyclin或者tamoxifen
inducible cre cross.需要induce的时候打taboxifen或者喂dox就可以了 |
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j****x
发帖数: 1704 | 32 除非你要在你的模型上完全mimic不同dosage所造成的不同表型，否则我确实不认为
knockdown在这里相比knockout有什么更多的好处，何况你说的这个情况，也可以用
knockout+knockin来更好的实现。当然，我所说的前提目前不存在，所以也就无所谓取
代RNAi了 |
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w*e
发帖数: 740 | 33 最近想做一个flag tag的knockin，看文献都觉得3xflag的效果好的多，想用3xflag。
但比较以后发现（sigma）网站，3xflag的序列并不是1xflag的三倍串联。而且1xflag
是8个氨基酸，而3xflag好像只有22个氨基酸/
不是很明白为什么不是24个氨基酸（而且是3个8aa的串联）？谁能解释一下？
谢谢 |
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l**********8
发帖数: 337 | 34 几个月前我还向老板提议做一个这样的老鼠，连knockin到Rosa26 locus想的都是一样
的，然后做genetic screening... |
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m*****z
发帖数: 1451 | 35 基本没戏。就算你的基因表达够强，BAC knockin效率可能远远低于FACS本身带来的
false positive GFP signal的比例。
clone |
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b******9
发帖数: 102 | 37 自己动手啊，又不是很难，addgene有现成的质粒，买来直接用，只要自己构个donor就
行了。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 39 这种东西如果老板不是实在穷我认为不应该花自己时间做。自己应该做那种没法外包的
探索性的，独特的东西 |
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b******9
发帖数: 102 | 40 你要做小鼠啊，国内的可以试试百奥赛图，他们这方面比较擅长。 |
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m*p
发帖数: 226 | 41 谢谢biows119, 我准备更他们联系了解一下。 |
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w*e
发帖数: 740 | 42 overexpression does not have to use knockin at ROSA26 locus. Transgenic
approach can achieve higher dosage. |
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o**4
发帖数: 35028 | 43 我的donar上没有筛选标志，也想用crispr跟ssODN做knockin，按照你说的效率极低，
heterozygous的效率都只有千分之一，那homozygous是不是没戏了？
要是你会挑多少克隆试试呢？
非常感谢。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 44 借问一下有人使用过 R26-CMV-CAS9 老鼠 JAX 024858 做过比如knockin 或者knockout
老鼠不。感觉好用不。 |
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j******i
发帖数: 939 | 48 做ipsc和CRISPR的人都挺多的。你不妨先介绍一下你自己的计划，别人才好说起。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 49 代谢疾病 正是遗传病里最常见已知的类别啊。不光是酶替代疗法（可以看看Genezyme
的信息）和昂贵的特殊饮食，还有现在最热的干细胞，CRISPR knockin，转基因，都被
你无视了啊。
结构蛋白也有办法，比如cystic fibrosis （美国最常见的隐性遗传病，白人中携带率
1/25）G551D这种突变，最近开发出一种药物针对这种点突变的异常蛋白有非常好的疗
效。当然钱也是滚滚而来
In the first 9 months of its second year on the market (2014), ivacaftor
sales were $339M
https://en.wikipedia.org/wiki/Ivacaftor |
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b****r
发帖数: 17995 | 50 代谢疾病 正是遗传病里最常见已知的类别啊。不光是酶替代疗法（可以看看Genezyme
的信息）和昂贵的特殊饮食，还有现在最热的干细胞，CRISPR knockin，转基因，都被
你无视了啊。
结构蛋白也有办法，比如cystic fibrosis （美国最常见的隐性遗传病，白人中携带率
1/25）G551D这种突变，最近开发出一种药物针对这种点突变的异常蛋白有非常好的疗
效。当然钱也是滚滚而来
In the first 9 months of its second year on the market (2014), ivacaftor
sales were $339M
https://en.wikipedia.org/wiki/Ivacaftor |
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