Q*****G
发帖数: 638 | 1 想在目的基因的N端或C端knockin GFP
利用cas9n d10a 载体，分别克隆２ guild RNA。
Donor repair template 突变掉guild RNA 序列。５＇和３＇flank分别为８００bp左
右.转染（LTX／Fugene HD）完３天可以看见荧光.可是传代后荧光非常弱，还可以做细
胞分选么？
通常转染后多久细胞分选?
是否有更好的方法可以提高荧光的强度和crispr的效率？
谢谢 |
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r***e
发帖数: 2539 | 2 谢谢，那就分开算了。
做点突变Knockin，没什么好的筛选方法，只能引入酶切位点做鉴定用，看来得慢慢挑克
隆了。 |
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z*******6
发帖数: 679 | 3 实验室一老博后十多年前“花了老大功夫”做了个knockin老鼠，我当然知道当年做老
鼠难做，他看了下没有想要的大phenotype，完了他就基本没往下做了，又做了几个其
他的老鼠，发现好phenotype就去做其他的了。五年前我进实验室，他就把老鼠转给我
了，我也基本没咋做，直到两年前才正式开始做，完了很快就做出点小phenotype和一
些in vivo的实验，老板也说可以了，我就写了manuscript，老板改完准备投，完了这
哥们说我要做cofirst author的第一位，结果我就无语了，毕竟是实验室的老人，而且
平常也帮了我不少，我就没说啥，老板也不知道咋弄，我就退一步让给他了...
最关键的是这哥们自己也说了，要是我不做，这个老鼠也就费了，估计永远也不会发了
；我这做完写完了，他突然来这么一下，我只能憋着了，谁让咱是苦逼学生没地位呢...
现在也就安慰安慰自己了，至少还是个cofirst，也不损失太多，没必要纠结了，况且
已经板上钉钉了，在郁闷也是自己受着了，没啥意思... 赶紧整完另一篇paper早毕业
闪人才是王道... |
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t****m
发帖数: 88 | 4 这里天天讨论怎么转行跳出火坑，其实还真有自愿跳进来的。我老板本人就是ee的硕士
后来读了biology（其实是bioegineering），如今也是不错学校的AP了。现在实验室又
来了一个新的graduate student，也是ee的硕士，以前intel的硅工，非要来学biology
。我现在天天带着他做knockin cell line，做pcr鉴定。心里感慨万千，特地来与大家
分享啊.... |
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m****a
发帖数: 270 | 5 我的个人理解是：转染质粒表达一般24小时到高峰，12小时还在增长期，此时转染gDNA
还能和新合成的Ago结合，24小时以后假如Ago蛋白turnover 的速率不够快，那就会导
致后转的 gDNA loading效率下降的问题。
再次转染说的是knockin实验，推荐在24小时的时候再次转gDNA是为了让更多的新合成
的Ago和gDNA结合，能起多大作用不知道，但并不矛盾。
NGAGO结合gDNA以及切割DNA的机制不清楚，肯定得继续接着做。
gDNA |
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b******9
发帖数: 102 | 6 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性率大概
在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
我个人觉得要注意以下几点：
1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在同源臂
PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好，做之
前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。
6.donor载体我直接用的pBluescript SK(+)，转之前线性化处理一下。
7.阳性克隆鉴定有条件的话上southern，没条件用PCR吧，注意在同源臂外面设计引物。
8.再有就是防止细胞污染。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 7 Es cell 的话不要筛选太久、puro 两天就够了，电转后二十四小时开始加药，4天以后
就可以挑克隆了
质粒不用线性化也有很高的效率
: 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性
率大概
: 在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
: 我个人觉得要注意以下几点：
: 1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
: 2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在
同源臂
: PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
: 3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
: 4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好
，做之
: 前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
: 5.转染... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 638 | 8 你lab现在有哪个系统，没有现成talen的还是先用crispr试试看，毕竟简单多了，不行
的话再换好在donor通用的，从头养一套talen系统太麻烦了，花在上面的时间说不定用
crispr克隆都出来了。
off-target谁都说不清楚，其实你要的knockin出来了没人关心怎么来的，反正
reviewer从来不问
听得我很犹豫。本来我们想用CRISPR 做的，但是听大家这么一说，看来我们还是用
talen做算了。因为反正我们要做的是定点突变，所以off-target 对于我们来讲不是特
别大的问题，因为切错的地方又正好给重组上去的概率应该很低吧？而且反正我们要加
筛选标记的，一开始切的效率高不高并不是一个特别大的考虑。 |
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m*****e
发帖数: 129 | 9 1 韩的方法最为简洁，方便。
2 他文章里用的cas9作为knockin的control，那个protocol也很clean。完全不用donor
plasmid， 直接合成flag/GFP containing gBlock，加上CAS9+gRNA， antibiotics筛
即可。 |
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H****N
发帖数: 997 | 10 这个直接打卵就行了，没必要转到ESC里面。但前提是你要有好的PROMOTER,因为有的
PROMOTER很长或者不知上界，需要用BAC做。最保险的方法是把你要表达的基因KNOCKIN
到一个在肝脏表达的基因里，这就需要ESC,但要花比较大的EFFORT。理论上CRISPR也可
以做，但目前用CRISPR做KI老鼠效率太低。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 哎呀你说的对。对于这么简单的任务其实刚受精的卵细胞就够了。
不需要开动胚胎干细胞。
肝脏特异的promoter 有好几个很好用的，应该不是问题。
KNOCKIN |
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j****n
发帖数: 3370 | 12 这么多钱 肯定是所有技术一起搞
说不定zfn talen也一起搞
听过某个公司的报告 zfn貌似比crispr更适合做大片段的knockin
其实更应该集中发展新的 crispr ago系统还有那么多未知的未开发 |
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m****a
发帖数: 270 | 13 仔细看了一下，文章中并没有给出具体knockin效率是多少， 作者用了G418筛选，
所以使用15bp的同源臂即使只有万分之一的重组概率也是有可能筛到stable cell line。
不用长一点同源臂不合常理，为什么这么搞，得去问韩春雨。
15 |
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s*********y
发帖数: 292 | 14 我主子是谁？
我在讨论NgAgo是不是假的。CRISPR不是讨论的范畴。而且我确定CRISPR是真的，我亲
手可以做出Knockin和knockout |
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a*****n
发帖数: 2835 | 15 需要共转pX260和ssDNA做knockin，感觉转染效率很低，很难筛到KI克隆
有没有好用的转染试剂推荐？ |
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发帖数: 1 | 16 八家都是既做了INDEL又做了KNOCKIN，MDZZ，侮辱智商啊
水军为什么不能找点专业人士，LOW |
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发帖数: 1 | 17 不是太懂，为什么Podicin promotor-GFP plasmid必须整合到基因组中才能发绿光呢？
你是要做knockin？ |
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g********0
发帖数: 6201 | 18 以现有crispr技术的水平，如果用在人身上，将会引起巨大的伦理道德争议，这是诺奖
委员会所极力避免的方向。如果用在动物身上，对推动科学研究也无突破性意义，因为
有更为成熟的knockout knockin技术，而且本身也不是开发crispr的初衷所在。
所以，诺奖将授予未来的一种解决了伦理道德争议的全新基因编辑技术。crispr将被作
为生物技术发展的一个里程碑事件而载入史册。 |
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j*******u
发帖数: 81 | 19 8,90年代做knockin/out的文章经常讨论这种东西 |
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l********e
发帖数: 415 | 20 不错，大赞。
如果为了研究目的，一个allele knockin, 一个allele knockout, 不是也可以么。 |
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发帖数: 1 | 21 Knockin的Gene, 结果很多WT也有弱条带。以前没有。
有人遇到过吗? 什么原因?怎么解决? |
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m*********D
发帖数: 1727 | 22 嘿嘿，生物研究不是让snowyday说成丐帮么。。。。我看我老板电话会议完了也有些失
望。但我给他说，我们发文章时方法写得太具体，任何人都能重复出来，也有几家实验
室说做出来了。我们也给出去两三家了，拿四千就四千吧。系里要拿两千也高兴。上次
看公司要价是18k，保证knockin，但不保证双拷贝。。。 |
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h*****G
发帖数: 113 | 23 hello, 各位大牛好。最近做了几个knockin的reporter line，需要检测是否有random
integration。看了一下都是用Southern Blotting, 但是我们组因为不做southern，基
本的东西都没有，比如hybridization oven。就想问一下，有没有其他的方法可以检测
，如果没有，有没有什么公司提供Southern blotting的service的。谢谢。 |
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发帖数: 1 | 24
我印象当中有人用reporter测过，但是做的很粗，也没有结合数学建模，结论并不显著。
你这个设想很有意思，如果能做出来会解决这个领域中的核心问题。当然这当中有几个
问题要注意一下：
1）对参与的基因和相互作用了解的不足和不准确，modeling和simulation会和实验有
偏差。当然后期可以根据实验数据进行model优化。
2）应该尽量选取网络的核心节点做reporter，这样测出来的动力学曲线含有更多的调
控信息。
3）从已有的文献个人感觉对于pluripotency基因网络，gene expression noise在调控
中的作用可能也很大，这说明用常微分方程建模可能会lose系统的一些内在性质，用随
机微分方程更好，但是计算和分析复杂度也相应提高。
4）pluripotency控制可能还伴随一些global的chromatin regulation，如何合理的进
行model也是一个问题。
我的建议是用system identification研究pluripotency基因控制网络的系统性质，至
于是正常分化还是重编程只是这个系统运行的不同状态而已。我估计研究正常分化... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 25 用荧光蛋白还是麻烦，能测试的数据少。只有你knockin的蛋白才会被研究。
如果能用单细胞测序就好了，能否通过密集取样，来得到动力学？
著。 |
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F*******I
发帖数: 200 | 30 几个问题：
第一： 您号称 natural free, 让我咋看很是有点激动， 再仔细一看帖子：
“第二阶段：一边怀孕，一边旁听kaplan，看看FA，看看Goljian，看了无数有雄心，
有壮志的考经，无数经验说要在生娃前考完；确实也看了1-2个月（每天2-3小时，好的
时候能够5-6小时），但是很快就过起夜夜笙歌，每天狂欢的无比快活日子。报名也报
了，kaplan，UW的钱也都交了，单科生化做完40%，感觉自己肯定考不了，担心自己
3rdtrimeser 倒在考场，还是生娃要紧，宣告结束。总结：身边需要1个楷模，一个可
以lead by example的人告诉你这件事情可行。
第三阶段：生完娃，自己带娃百无聊赖，终于在考试达人（母亲大人）的谈话中，又一
次开启，买了2013版的FA和UW，开始算正式上路。也就2个月，跟组，终于有点开窍。
母亲大人的话，就是考试嘛，就是刷题。一遍刷不过，2遍；2遍刷不过，3遍。强大的
鼓劲下，我刷了5遍UW的生化，也就5个block的生化，成为我后面的强项。即便这次考
试生化没考好，我也能很自豪的说生化，我不怕，任何一个惧怕生化的人，我可以1天
内让... 阅读全帖 |
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a****y
发帖数: 1035 | 31 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: 讲讲我的生物创业过程
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 8 09:21:11 2013, 美东)
我因为最近一直在中国，所以来这里很少了。这次回美国来再到这个版，读帖子觉
得非常亲切，不管是积极的还是消极的，都还是那样熟悉。一时心血来潮就想写点自己
的经历，希望对学生物的朋友有点帮助，或者至少知道还有别的路可以试试。没想到会
有这么多的网友读了，并得到了这么多的祝福与鼓励。非常感谢大家。尤其是好多朋友
还给了非常具体的建议，包括知识产权建议（这些我们已经意识到并跟一个知识产权律
师事务所签订了服务协议）、公司运作方法建议、未来公司应该发展的方向等等。这些
都让我受益匪浅。现在不是我的帖子给大家鼓励了，而是我从大家的回复中获得了很多
的灵感，这对我后面把公司做好非常有益处。
本来在这里是写着玩儿的，以我以前的经验来看，读者应该不过几百人或最多1、2
千人。现在看到这么多人来读，并已经有人把这个帖子转到了国内微博上，我还真有... 阅读全帖 |
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S*****s
发帖数: 287 | 32 这个贴光是 Re 的回帖太多了，找半天才看到你的问题。我们实验室涉及的方向比较杂
，做什么的人都有，所以我什么都沾一点。我们做的是癫痫病的 channelopathy，就是
离子通道异常引起的癫痫。Seizure 一般都是突然发作，完毕之后在很短的时间内恢复
常态，这个和离子通道 fast activation fast deactivation 的特点满符合。而且目
前在 Calcium channel, sodium channel, GABAA receptor (Chloride channel) 里都
发现了和癫痫有关的突变，而且做成 knockin 老鼠之后在老鼠上也发现了癫痫。这些
都说明 channelopathy 满靠谱。这个应该就是你说的 intrinsic 的离子机制吧。
hippocampus 应该是和 temporal lobe epilepsy 有关系，是 hippocampus 和 皮层之
间的 oscillation 发生了异常。 TLE 是一个 partial epilepsy，只涉及到大脑皮层
的某一个区域功能增强。我们的癫痫研究和 thalamu... 阅读全帖 |
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S*****s
发帖数: 287 | 33 这个贴光是 Re 的回帖太多了，找半天才看到你的问题。我们实验室涉及的方向比较杂
，做什么的人都有，所以我什么都沾一点。我们做的是癫痫病的 channelopathy，就是
离子通道异常引起的癫痫。Seizure 一般都是突然发作，完毕之后在很短的时间内恢复
常态，这个和离子通道 fast activation fast deactivation 的特点满符合。而且目
前在 Calcium channel, sodium channel, GABAA receptor (Chloride channel) 里都
发现了和癫痫有关的突变，而且做成 knockin 老鼠之后在老鼠上也发现了癫痫。这些
都说明 channelopathy 满靠谱。这个应该就是你说的 intrinsic 的离子机制吧。
hippocampus 应该是和 temporal lobe epilepsy 有关系，是 hippocampus 和 皮层之
间的 oscillation 发生了异常。 TLE 是一个 partial epilepsy，只涉及到大脑皮层
的某一个区域功能增强。我们的癫痫研究和 thalamu... 阅读全帖 |
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R*******e
发帖数: 25533 | 36 We Take Care Of Our Own
http://www.youtube.com/watch?v=M3Bz0d2xm7U
I've been knockin' on the door that holds the throne
I've been lookin' for the map that leads me home
I've been stumblin' on good hearts turned to stone
The road of good intentions has gone dry as bone
We take care of our own
We take care of our own
Wherever this flag's flown
We take care of our own
From Chicago to New Orleans
From the muscle to the bone
From the shotgun shack to the Superdome
We yelled "help" but the cavalry sta... 阅读全帖 |
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R*****n
发帖数: 526 | 37 本来想献上的是Mr. Tambourine Man，可杂音太大，这几天在鼓捣Knockin' on Heaven
's Door。不知道帮主比较喜欢哪几首？ |
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b*******b
发帖数: 30 | 38 Biocytogen 是一家致力于制备基因
改造小鼠模型和新药研发的生物技术公司。
现诚聘：
Project managers/Scientists。
要求：具有博士学位。有设计制备
knockout/knockin 小鼠的经验。
流利的英文口语交流能力，组织沟通能力。
Technician: 生物专业，两年以上实验室工作经验。良好的英语口语和
书面交流能力。
请将简历寄到 [email protected] |
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