d******0
发帖数: 1598 | 1 12 导演手记（六）
关于“二人转”：
“二人转”虽然在县城流行，但我只看过两次。一次是某年寒假，从省城坐大巴回
县里，前面坐了一对年轻恋人。女的一听就是我们县的。男的是一南方哥们儿，大南方
那边儿的，戴眼镜，穿羽绒服。估计是长途旅行，外加头一回见识到什么叫零下三十度
，那哥们儿一脸的油光锃亮。
七个小时的长途大巴，开到一半，乘务员开始放“片儿”。其实就是装在大巴上的
一个显示屏，连了简易的存储器，存的那些视频文件，便是“片儿”了。说白了就是一
长途大巴版的录像厅，多以动作片为主。乘务员先上叶问，乘客一起喊“换台”（他们
把大巴上的显示器当成了家里的电视机）；再上迪卡普里奥，又喊“换台”；无奈，只
好祭出“二人转”，乘客们才善罢甘休。
我晕车，特别晕长途大客。一看时间，还有三个小时，心说到家之前不吐出来就算
胜利。前面那哥们儿很兴奋，搂着我们县姑娘说“终于看到传说中的二人转了”。
女的对男朋友笑了。虽然我不认识这姑娘，但这一笑却感觉熟悉。因为我们县里的
姑娘如果真心喜欢你，她们就会对你这么笑，一眼就能看出来。
二人转开始了：一男一女，站在台上插科打诨。男的矮且丑；女的相反，高且丰满
，... 阅读全帖 |
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c***u
发帖数: 3888 | 2 建议配上GNR的 Knockin' on Heaven's Door 为配乐 |
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n********k
发帖数: 2818 | 3 That's super, u deserve a raise:)))...so may i have your super protocol...
might need to do a lot of
knockout/knockin sometime in my future |
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n********k
发帖数: 2818 | 4 it is a totally different question now...u are talking about two
recombination events or hope to have one non-
perfect recombination event so that u can get in both ur knockin arm and
another 100bp with ur long arm...I
don't know, it could be tricky..I have a friend who did similar things but
used double selections... don't really
have experience with this, so maybe someone else could help...BTW, u could
have asked question more
clearly...no biggie |
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s********n
发帖数: 2939 | 5 要做一些E. coli的KO和KI，据我所知有好些方法，有没有一些比较常用有效的，最好
是不需要marker的。
Thanks a lot! |
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l**********k
发帖数: 189 | 9 发一个广告，但愿板主不删掉。
我们公司是一家成立两年，快速成长的生物技术公司，主要是开发制备基因
修饰的小鼠模型，用于进行药物筛选或是以商业形式提供给科研机构。同时
也为客户提供基因剔除类CRO服务。因公司扩大，我们需要招聘以下人才：
Project managers/Scientists （1－2位）。
要求：具有博士学位。有丰富的设计及制备 knockout/knockin 小鼠的经验。
流利的英文口语交流能力，组织沟通能力。善于处理人际关系。喜欢读paper
，善于紧跟科学发展的前沿。
Marketing (1 人）
要求：具有生物相关专业毕业。学习能力强。流利的英文口语交流能力。有
相关marketing经验最好。
Microinjection Technician (1-2人）。
需要：有多年小鼠ES细胞和DNA显微注射经验。流利的英文口语交流能力。
公司地址在麻州中部 (Worcester)。 公司网站：www.biocytogen.com.
如果您对我们的职位感兴趣，请将您的简历投到 [email protected] |
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G******O
发帖数: 189 | 10 Are you going to make a knockin mouse? |
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y***i
发帖数: 11639 | 11 Enough for lethal genes ---- EMS to "knockout" and transgenic to rescue or
"knockin".
I feel that mosaic is more useful in many respects. |
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D*a
发帖数: 6830 | 12 a++为什么不能活？knockin么？是的话不能用－/－，应该是＋/0
c++也是一样的问题
background你要是没有办法弄成一样的就照直写就行了，也可以说这样有variation所
以跟自然生物界的更接近blablabla，
如果你phenotype强的话肯定没问题。另外也看你怎么定义多用几只老鼠了，我们一样
的background用的老鼠都是10只以上，8只就是没办法了，四五只就是实在没办法了 |
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l**********k
发帖数: 189 | 13 请版主保留，非常感谢。
Biocytogen 是一家致力于制备基因
改造小鼠模型和新药研发的生物技术
公司。现诚聘：
Project managers/Scientists。
要求：具有博士学位。有设计制备
knockout/knockin 小鼠的经验。
流利的英文口语交流能力，组织沟通能力。
Technician: 生物专业，两年以上实验室工作经验。良好的英语口语和
书面交流能力。
请将简历寄到 [email protected]
谢谢。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 14 好像tissue culture里面可以knockin，但是成功率非常低，要筛无数的clones。。。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 15 不一定要完全和in vivo 一样啊
只要能让大家有一个比现有的model不一样，而且有一定理论上的优势，就是个值得一
试的东西
现在大家主要是想用这个in vitro的东西screen for drug和其他therapy了，比老鼠便
宜，周期
可能更短，有可能更接近病人的实际情况。毕竟人的干细胞是很难knockout knockin的
，而病人
的白细胞和皮肤细胞还是很容易拿到的
a
and
domain |
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D***y
发帖数: 693 | 16 用过，做了几个knockin老鼠。也没有什么特别的。我用的是XL1-blue |
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S*****s
发帖数: 287 | 17 Sigh，有的领域最好的杂志也不过三四分，能发就很好啊。
记得我有一次看到有一篇关于 Knockin animal 的文章发表到 Annals of Neurology
上了，打印出来给老板看，说花这么多钱做出来的动物，只能发这种点数的杂志，太可
惜。老板说，Annals of Neurology 是 Neurology 方向排名第二的杂志，这样的文章
能发到这本杂志上已经是很过分了。之后我看杂志就开始注意它在本领域里的位置了。 |
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b******r
发帖数: 111 | 18 I am doing a knockin project. I have done constructs which contain Neo and
HSV-TK for selection in ES cells.
How do I know Neo and HSV-TK in my plasmid work? Specificly,
Do Neo and HSV-TK genes in my plasmids express their proteins in E.Coli? I
tested in this way: grow 4 tubes
of E.Coli, when adding G418, E.Coli can't grow; When adding gancyclovir, E.
Cori grow well. That means Neo
and HSV-TK genes of my plasmids don't express in E.Coli, right? Then why
do Neo and HSV-TK express in
ES cells? ... 阅读全帖 |
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s****9
发帖数: 932 | 19 I guess he or she means BAC transgenic. |
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O******e
发帖数: 4845 | 20 那就不能叫做knock-in了
我也没听说过用genomic DNA来做KI的，一般的基因都太大了 |
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l*****g
发帖数: 43 | 21 有。用人基因代替老鼠基因，3到4个exon。是公司做的，没看见发表文章
如果是转基因，什么时候用cDNA，什么时候用G DNA？什么考究呢？ |
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s****9
发帖数: 932 | 22 Unclear there were defined promoter or transcriptional factor binding cites
in the introns, there is no reason to include introns. |
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z*******6
发帖数: 679 | 23 其实算是寻找fibrosis的origin cell吧。。。大家做fibrosis有啥前途，我看了老板
的grant application，除了有所谓的科学问题（也就是很多东西不知道，然后需要研
究）以外，总觉得做fibrosis不是很靠谱。。。
在一个新实验室rotation，老板破四道刚毕业，然后拿了个好的knockin模型就独立实
验室里，目前还木有任何grant，用的是研究所的startup，自己感觉挺舒服，也好几个
人建议说这哥们看问题挺准的，模型也挺好，聊天也肆无忌惮，什么都说，什么都问，
完全当同学的感觉。。。就是总是不放心新pi，纠结的不行。。。
想听听大家的建议。。。 |
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c****l
发帖数: 1086 | 24 Increased PDGFRα Activation Disrupts Connective Tissue Development and
Drives Systemic Fibrosis
Lorin E. Olson and Philippe Soriano
你的systemic firosis的model 是指这个吗，PDGFRA 的 D842V 的knockin mouse
model？
出了这个，还有什么其他model吗 |
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z*******6
发帖数: 679 | 25 其实算是寻找fibrosis的origin cell吧。。。大家做fibrosis有啥前途，我看了老板
的grant application，除了有所谓的科学问题（也就是很多东西不知道，然后需要研
究）以外，总觉得做fibrosis不是很靠谱。。。
在一个新实验室rotation，老板破四道刚毕业，然后拿了个好的knockin模型就独立实
验室里，目前还木有任何grant，用的是研究所的startup，自己感觉挺舒服，也好几个
人建议说这哥们看问题挺准的，模型也挺好，聊天也肆无忌惮，什么都说，什么都问，
完全当同学的感觉。。。就是总是不放心新pi，纠结的不行。。。
想听听大家的建议。。。 |
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c****l
发帖数: 1086 | 26 Increased PDGFRα Activation Disrupts Connective Tissue Development and
Drives Systemic Fibrosis
Lorin E. Olson and Philippe Soriano
你的systemic firosis的model 是指这个吗，PDGFRA 的 D842V 的knockin mouse
model？
出了这个，还有什么其他model吗 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 27 In familial but not sporadic AD, APP and PS is 100% autosomal dominant.
It could be either APP or PS1, I haven't heard of any case where both APP
and PS1 mutation were identified.
A transgenic/knockin/out mouse model is a good research tool, but could
tweak the research too much for therapeutic development to focus on a sub-
optimal target. This is particularly true for diseases with unknown/
unidentified etiology.
I am not familiar with autism, but I think both sporadic AD and autism
belong to ... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 28 其实这个基因是当年老板自己做postdoc的时候knockin的 |
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Z******5
发帖数: 435 | 29 为什么很多重要的基因只有一个拷贝，我觉得也可以从这个角度来看：
这个基因最开始出现应该是只有一个，这个单拷贝已经能够支持其行使正常的功能了。
当出现多于一个拷贝的时候，这个基因表达量的改变可能导致生物体发育出现异常，不
能稳定遗传下去。
这个假设应该可以通过一些knockin的实验来验证吧。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 30 用ZFN做直接knockin是不行的（也就老鼠还行，人细胞和fish的HM比率都非常低） |
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S*****s
发帖数: 287 | 31 艳阳天前辈的确很尖锐，一下子就把重点说出来了，我也很受教。我马上要找工作，我
的计划是如果进不了好实验室就进公司，你的话也提醒了我。我真正工作过的地方也就
是两个实验室，也许还是找个尽可能好的实验室做个博后之后再考虑公司比较好。或者
找博后的时候进和公司关系比较紧密的实验室，了解一下情况再决定这条路是不是适合
我。
我倒是不反感 Politics。我现在的实验室里有一个很 dominant 的小老板，我们俩都
是做分子的，我刚进实验室的时候其他人还是以电生理为主，所以她用了不少手段阻碍
我的实验想把我挤走。我只觉得如果我想把课题做下去的话，就一定要处理好这些来自
实验室其他人的压力。幸亏我们的这个小老板手段并不是特别高明，我稍微留心一下就
能看出个端倪找到解决方法，时间久了也就把我给锻炼出来了，我还蛮感谢她。 Dua
帖子里提到 Politics 的方式似乎是把 Politics 当成耍手段来解释，这和我的理解方
式完全不一样。我进实验室只有一个目标，就是因为我喜欢这个实验室的 Science 想
在这个方向做出我的贡献。我理解的 Politics 就是排除环境干扰的方法。我的
Pol... 阅读全帖 |
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s*******s
发帖数: 623 | 32 Job ID: GF2011A001
Posting Title: Research Scientist/Research Associate/Bacterial Geneticist
Brief Introduction of Gate Fuels Inc.: “Imagination, Innovation,
Implementation --- Enabled Technologies for a Green Clean World”
Gate Fuels Inc. is a research start-up firm based in Blacksburg, VA, with
the goal of developing microbial and cell-free platform technologies that
enable low-cost production of biochemicals and biofuels. The first platform
is based on industrially-safe Bacillus subtilis. Thi... 阅读全帖 |
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b*****o
发帖数: 150 | 33 You don't have to add polyA to your cDNA
The knockin construct normally has its own promoter and polyA region.The expression cassette will be randomly inserted into (any) genomic DNA.
What's your mean "allele"?
When use "allele" it normally means "the genomic region of the gene", you can delete, mutate or add (tags etc) to any part of your allele in vitro, then knock it in.
allelle |
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d****d
发帖数: 214 | 34 你都做了Figure2-10了，那你毫无疑问应该是第一作者了。
做电镜的合作者的地位取决于Figure 1有多重要了。我知道有不少光做了knockin 或
knockout 的人作了共同第一作者。
即使Figure 1 单独发文章，你也可以争取作该文章的共同第一作者。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 35 你老板没让你事先设计 reporter+ cassette modified vector 就做plasmid then
BAC transgene to Mouse 啦?
then 要证明Your transgene（insert）整合到特定locus
if yes plus next Long-range PCR does not work well.
return to start point then do below steps or similar steps:
Generation of knockin mice
Bacterial artificial chromosome (BAC) clone RP23-135A18
containing mouse genomic DNA encoding exon 1 of Zeb1 was
digested with PacI/SphI and SphI to yield 7.6-kb and 2.6-kb
homology arms, respectively, for targeting constructs (Figur... 阅读全帖 |
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a*****x
发帖数: 901 | 36 我们有做SILAC的facility，跟那个人谈过，他说我们目标蛋白没法做，他以前做过直
接的MS也做不出来（是个著名的难做蛋白，又会aggregate, 又有太多cleavage，还有
无数多修饰等。
不想用CHX因为这个蛋白虽然half life不清楚，但是基本肯定是slow turnover，大于
36小时。CHX treat我们的knockin cell line，cell吃不消。不过实在不行就做做试试。
此外你觉得如果siRNA 24小时内就knock-down 〉90%,而protein 24小时内只降低20%左
右，72小时后降低90%，那么可以默认转siRNA后24到72小时之间主要是protein 的
degradation吗？
包子随后附上 |
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a*****g
发帖数: 543 | 37 KO也可以做成reversible(加上一个knockin). 另外KO也可以inducible (timing
control）
还是那句话，RNAi做出来的很多结果都是off-target effect。有人投钱做过了。
如果没有cre/rTTA，那你的RNAi也没法保证 tissue specificity吧？ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 38 brown fat related to hibernation.
and upc3 is mainly express here.
I think this one definitely related to mitochondria,
could you knockout/knockin it in cells or use your mouse heart mitochondria
to do seahorse to measure mitochondria function? |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
麻烦来了
1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
commercial的 |
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O******e
发帖数: 4845 | 40 1. Most likly.
2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗
位置 |
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m******5
发帖数: 1383 | 41 1,most likely yes or no? |
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m******5
发帖数: 1383 | 43 Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
正四处找commercial的 |
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s******r
发帖数: 2876 | 44 马上做一个大肠杆菌的表达construct.
共转大肠杆菌不就行了。
Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
正四处找commercial的 |
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a******8
发帖数: 56 | 47 In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
PCR for 3'UTR or others)? Good luck. |
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m******5
发帖数: 1383 | 48 because they use reversed direction... |
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s******r
发帖数: 2876 | 49 最多一个礼拜，你跟别人要来菌株也差不多时间。
that takes time... |
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a******8
发帖数: 56 | 50 Not necessarily.the mRNA splicing from the same genomic locus can be
different when using different promoters. There are many successful examples
when NeoR is in forward direction. |
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