s*********i
发帖数: 53 | 1 太高深了，看不懂哎。
不过还是要谢谢你，
头像是画。
也没有sunny啥啥的出没了。
Sanger的啦，很没创意。
一线，三点成一面，是公理，不须
针对进化论耐心替我洗脑，－－－更糊涂 |
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t*d
发帖数: 1290 | 2 不带这么吓人的。敢情 ChIP 是个比中国房地产还大的 bubble。
protein |
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A******y
发帖数: 2041 | 4 Magnetic bead + crosslink...if not, the literature is b.s. Also, did the
protocol uses over-expressed protein system? and are you? |
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f******r
发帖数: 96 | 5 谢谢各位:
@ArtyArty:我是用原代培养的神经元做co-IP的。你一般用什么crosslink啊？磁珠会好
么？ |
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d****7
发帖数: 109 | 6 嗯，能，连上反而更好，我用Sigma V5-10 Mouse monoclonal Ab，这抗体是IgG1，与
protein G结合拒差，我就用DMP把V5定到protein G上，然后IP效率奇高。
后来我不想每次做IP都crosslink，所以就换了一个beads，叫Dynabeads Pan Mouse
IgG，这个beads能与各型mouse IgG的Fc段结合，结合力很高，不是做广告，确实不错。 |
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m*p
发帖数: 226 | 7 用一家公司的单抗 (mouse IgG) 做CrossLink Immunoprecipitation. 银染和靠马氏良
染结果都很好。 主带（target protein) 很明显出现在正确的位置, 而且抗体的
pulldown比对照IgG多很多条带。 所以送到一家公司protein identification. 有大约
40个蛋白只出现在样品里，而对照没有。
根据Mass-Spect 的结果，奇怪的是主带（target protein)居然不是这个抗体识别的蛋
白， 虽然大小根这个识别的蛋白是一样。其实这个应该识别的蛋白就根本没有被检测
到。
于是我拿这个抗体去做wb 和 ihc。 发现ko 的样品还有这个蛋白，没有比对照少。我
很确信ko，因为phenotype 很明显，Q-PCR 证明85％－95％ ko.
我怀疑这家公司在制作抗体的过程中，根本没做antibody validation， 或者做了，认
为size一样的就是正确的抗体。
我花了大约7000刀，4个礼拜的时间。 我能叫他们赔偿吗？
我不知写清楚没有。 谢各位的反馈。 |
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y*********u
发帖数: 183 | 8 CHIP-Re CHIP;
Crosslinking and subsequent Western/Southern, and LC-MS downstream of it;
CO-IP using locus knock out cell line as control;
etc |
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l****y
发帖数: 398 | 9 sorry to be negative.
But it seems anything based on affinity purification-MS won't work.
As far as i know, people have tried all sorts of tricks (crosslinking,
minichromatin,targeted cleavage, silac)and failed.
The nonspecific background is ridiculous. It is like every protein is there.
Of course, sometimes a lucky person can pick out one interesting protein by
sharp instinct. but in general, it fails.
if you can make it work as well as CHIP,you get a career. |
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s******s
发帖数: 13035 | 10 大家参考一下。其实我是没有精力做的，有人成功的话给我acknowledge就够了。
找你要研究的基因的BAC，然后再E.Coli里面通过homologous recombination在
有兴趣的片段（当然要比较长的）两头加rare的RE site或者ZFN一类的，随便折
腾；里面再加点strong的aptamer, 或者变态点，加一堆lacO.
这玩意儿做成转基因IPS或者ES，好处是可以多copy, 十个八个没问题吧，更多
应该也行吧? 然后做成转基因小鼠，取你有兴趣的特定组织，或者细胞培养，
做ChIP的前面部分就是fix，洗掉细胞质，然后instead of sonication, 用RE
一顿乱切，配合aptamer purification. 你可以先size select然后affinity,
或者先affinity然后size select, 或者几种不同的方法series affinity，
anyway, 拿到东西decrosslinking上ms spec, 当然前面crosslink的时候不能
用glycine quench.
这个思路欢迎大家补充。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 11 说实话，那个PICH我还没有全部理解。
理论上，sonicate以后，不被protein protect的DNA应该断掉了，
但是杂交的时候，被protein crosslink的部分应该不容易杂上吧？
是不是和前面有人说的telomere的所谓特殊结构有关系?
year
and |
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i*****g
发帖数: 11893 | 12 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
2. 含量越低，越不容易检测到
3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾 |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 http://www.digitaljournal.com/article/311591
Though 3D printing rapidly produces 3-dimensional objects, including
microstructures, from diverse materials by applying layers and bonding them
with UV radiation, this advanced technology is still too imprecise to
generate ultra-fine, complex capillary vessels, so the researchers developed
a two-photon polymerization process, where intense, brief, highly focused
laser pulses strike the material, stimulating a crosslinking between
molecules, and the m... 阅读全帖 |
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h*****t
发帖数: 1226 | 15 You can reduce the protein, digest with lys-C or trypsin, deglucosylated
with PNGase F, then run LC-MS/MS, data base search to see if you can see any
protein Identified. |
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s******s
发帖数: 13035 | 16 native完全不用crosslink的ChIP都有，这个显然没问题。
你的啥细胞？一般sonication都能打碎，不过我以前试过thymus，
确实老是粘在一起 |
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m*********n
发帖数: 158 | 17 endogenous protein pulldown,以前都是harvest cell lysis，然后antibody incubation overnight, next day add
beads for 1-2hours, and pulldown
听说把beads先和antibody cross link一下，可以提高pulldown efficiency;
所以准备把antibody-bead cross link,加到cell lysis,这样得话，大家一般incubate
在cell lysis里面多久呀？
谢谢 |
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c********r
发帖数: 189 | 19 1） crosslink your antibody with the beads
2) elute with 0.1M glycine(pH 2.5) |
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C**S
发帖数: 522 | 20 我先用DMSO溶解DSP，再加到无钙镁的PBS里，立刻就形成大量结晶状沉淀。求教问题出
在哪里？ |
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s******9
发帖数: 283 | 21 what's your DSP final concentration in PBS? |
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C**S
发帖数: 522 | 22 先用DMSO配成10mM，1:10加到PBS里。 |
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s******9
发帖数: 283 | 23 you might lower the concentration or use DTSSP. |
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C**S
发帖数: 522 | 24 说明书上说最终浓度可以是1~2mM。1mM应该没问题，想找出问题出在哪里。 |
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C**S
发帖数: 522 | 27 没检查过PH，开过瓶的PBS的PH会变化很大吗？为什么PH值不对会导致沉淀？ |
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d*******8
发帖数: 93 | 28 I use Chaps buffer instead of PBS, I never have any problem. Would try Chaps? |
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C**S
发帖数: 522 | 29 谢谢，我试试看。还有一个问题，你们用DSP都是买小包装的，一次用光吗？溶在DMSO
里，分装冻在-80可以吗？
Chaps? |
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c********b
发帖数: 363 | 30 楼上的思路不错。
其实方法很多，但是比较简单的还是先crosslink，然后再用 harsh buffer把核裂开，
然后复性，最后该干嘛干嘛。
这里有一篇你可以参考：Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI
/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling
我自己用的protocol是这样的：
如果只是检测蛋白表达:
用High SDS buffer:
15 mM Tris pH 8.8, 5% SDS
0.3 M DTT, 15% Glycerol
我的是植物细胞,一般是liquid nitrogen grind之后加buffer,boil.如果是cell line,
collect细胞之后加上buffer 然后直接煮.除非是非常不稳定的蛋白,不然连protease
inhibitor都可以不加.
看到蛋白之后如果是做IP:
先crosslonk(用什么chemical得自己琢磨),然后把ripa的SDS含量加到1% ,... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 189 | 31
刚cruise回来，你的方法不错，可以试试，这个蛋白不是很稳定，可能先crosslink下
比较好？ |
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g*******f
发帖数: 427 | 32 我估计你是sonication 后直接拿来跑胶的。你得完全按照ChIP的样品处理方法reverse
crosslink 后用 phenol chloroform 纯化DNA 后再跑胶，你就会看到富集的小片段了
，而不是smear |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 //products.invitrogen.com/ivgn/product/G2879
is half price of GE Life Glutathione Sepharose™ High Performance
Description
Glutathione agarose prepared by linking the sulfur atom of glutathione to crosslinked beaded agarose can
be used for purification of GST fusion proteins. Each milliliter of gel can bind approximately 5-6 mg of
boivine-liver GST.
-------
GE Life Glutathione Sepharose™ High Performance
Binding capacity* » 10 mg recombinant GST/ml medium
* Binding capacity wil... 阅读全帖 |
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n**8
发帖数: 221 | 34 没做过这个，但如果我是你，我会试试这两个条件，
1.) ATP analog
2.）实在不行，就crosslink，这个要设计好control。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 36 PIERCE有一整套可以跟primary amine反应label蛋白的
还可以看他们的protein crosslinking书
网上免费下 |
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k******0
发帖数: 1073 | 37 试图纯化protein phosphatase PP1 复合体，蛋白质在1mM DTT （含Mn离子），但过了
3，4天，蛋白质开始沉淀，此时加入更多DTT，蛋白质又稳定了。发现Pp1有13个
cysteine，没有双硫键，可能是这些cysteine crosslink蛋白质。
TCEP可以保持蛋白质更长时间。尝试5mM，不知蛋白质能稳定几天。正在检测中。
有没有xdjm有纯化PP1的经验，如何克服这氧化的问题？是否可以alkylate 这些
cysteine？ 多谢解答。 |
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w********e
发帖数: 1416 | 38 估计你是想问input control吧？一般用genomic DNA. 细胞数尽量parallel就行了，因
为你可能很难控制得那么好，但是得保证细胞密度尽量相近，因为会影响crosslinking
的效果。
这个实验很容易false results.多设几个negative control. 上面一个提到用不相关抗
体是个通用的方法。
力。
region
input |
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k*****n
发帖数: 323 | 39 make sure your crosslinking and sonication are consistent. take Pol II as
system control. |
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t**********8
发帖数: 223 | 40 我现在用的protocol，是crosslinking后用0.5%的SDS lysis cells。我见网上很多
protocol都是用1%的SDS，因为我的蛋白可能比较难抽，我就改用1%的SDS做，结果比0.
5%的SDS回收率还低。大家一般是用哪个浓度啊？谢谢！ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 41 http://en.wikipedia.org/wiki/Cisplatin
Cisplatin, cisplatinum, or cis-diamminedichloroplatinum(II)[1] (CDDP) (trade
name Cisplatin,brand name Platin marketed by Cadila Healthcare according to
FDA Orange Book) is a chemotherapy drug. It was the first member of a class
of platinum-containing anti-cancer drugs, which now also includes
carboplatin and oxaliplatin. These platinum complexes react in vivo, binding
to and causing crosslinking of DNA, which ultimately triggers apoptosis (
programmed cell... 阅读全帖 |
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y***y
发帖数: 709 | 42 您可以稍微解释一下您说的in vivo crosslink吗？
我们已经做了MS，并确认了几个位点确实有磷酸化
我坐在这里想象一下：
如果有这么一种slide，上面点着各种不同激酶的特异性抗体，当用激酶的混合物和
slide杂交之后，激酶就会结合在各自的抗体之上，洗掉激酶混合物以及非特异性结合
之后，放在目标蛋白和标记了的ATP溶液中，一段时间后加蛋白交联剂，把和激酶作用
的目标蛋白交联在激酶和抗体复合物上，洗脱，扫片子，有标记信号的点表示该抗体所
对应的激酶们就是目标蛋白磷酸化的激酶。
这个实验能够实现的话，那就是满足我需要的dream experiment。其中最难的应该是蛋
白交联这一步了。如果有公司想研发这种真正的kinase profiling的话，尽管拿这个
idea去研发，我不收专利费，哈哈 |
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S*********s
发帖数: 304 | 43 恩，你还需要做的一件事就是确认那些posphorylation site是重要的，有功能的。
你需要做
knockdown, then rescue with S/T to A mutant and S/T to D/E mutant.
因为很多磷酸化位点虽然发生了，但是没功能。
你想象的想法很好，一不需要抗体，公司一般直接是把tagged kinase放在slide上
二。这个实验很dirty, kinase能磷酸化很多蛋白，特异性不够。
我说的是in vivo crosslink，用你的蛋白把kinase拉下来，但没有那么容易做。
我的感觉是，你需要多读一些kinase研究相关的paper.
Good luck. |
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S*********s
发帖数: 304 | 44 many kinase/substrate interaction is transient
can not get interaction by IP unless using crosslinker |
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s******y
发帖数: 28562 | 45 听起来是你的两个蛋白会形成比较复杂的高聚物或者aggregate
有没有考虑过大大降低你的蛋白的浓度？
另外，一个方法就是把其中一个蛋白crosslink 到agarose 的表面，这样一样就不会
形成aggregate了，因为其中一个的分布浓度被强行固定了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 大大降低浓度是说纯化以后的蛋白大大降低浓度然后加在一起？
还是说共表达的这一步，比如不加IPTG，同时表达groESL之类的？
忘了说，蛋白A有一个GSTtag的version
用过magnetic beads
一样的，上清液一加到magnetic beads以后
beads立刻变成一整块，完全没有办法吹洗
就好像被什么东西crosslink了一样 |
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m*******u
发帖数: 173 | 47 crosslink 是把抗体和beads cross link 吧， 保证IgG 不被洗脱下来。 你用的HA抗
体还是GFP抗体做的IP？ 我现在也在烟草里做 co-ip 可以站内联系 交流一下。 |
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n******2
发帖数: 971 | 48 大牛，请给详细指点一下。例如，我用proteinase K 处理reverse crosslink后的DNA
：蛋白溶液，这个过程前后的peak会移位吗，高度会下降吗？ |
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m*********r
发帖数: 49 | 49
多谢了，agarose容易变形这点我以前倒是没注意。 |
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m*********r
发帖数: 49 | 50 非高手，楼主这个和我最近做的有点类似。我是把抗体crosslink到protein A/G beads
上，IP之后用酸洗脱，heavy chain几乎很少洗脱下来。不知道有没有帮助。 |
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