b****r
发帖数: 17995 | 1 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
的binding 能力）。
我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 应该吧。
是不是最好在找个和A无关的C做一下control
力。
region
input
【在 b****r 的大作中提到】
: 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
: 我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
: 基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
: 子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
: 的binding 能力）。
: 我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
: DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？
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g*****n
发帖数: 250 | 3 借题发挥一下。我见过很多这样的实验,就是搞不明白。
这个方法能回答“binding 能力（affinity)”的问题吗？用ChiP所测出来的DNA量的增
高能说明B蛋白的“binding 能力”的增强吗？我觉得，这表明含有B蛋白binding的细
胞增多了。也就是说，A刺激了B在更多的细胞里表达。
力。
region
input
【在 b****r 的大作中提到】
: 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
: 我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
: 基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
: 子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
: 的binding 能力）。
: 我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
: DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？
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l********e
发帖数: 415 | 4 这种最好用cell free system / in vitro translated protein 和sythesized DNA
力。
region
input
【在 b****r 的大作中提到】
: 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
: 我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
: 基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
: 子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
: 的binding 能力）。
: 我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
: DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？
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z*******a
发帖数: 175 | 5 non-specific binding by protein B can be used as internal control |
O******e
发帖数: 4845 | 6 这个实验设计太粗放了，结果不好解释。你至少要结合knockdown的实验才能大体知道
个方向。做overexpression的实验，mock transfection是个非常不好的control.最起码
你得转个空质粒做对照。
力。
region
input
【在 b****r 的大作中提到】
: 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
: 我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
: 基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
: 子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
: 的binding 能力）。
: 我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
: DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？
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w********e
发帖数: 1416 | 7 估计你是想问input control吧？一般用genomic DNA. 细胞数尽量parallel就行了，因
为你可能很难控制得那么好，但是得保证细胞密度尽量相近，因为会影响crosslinking
的效果。
这个实验很容易false results.多设几个negative control. 上面一个提到用不相关抗
体是个通用的方法。
力。
region
input
【在 b****r 的大作中提到】
: 假设我的假说是A蛋白的表达会增强转录因子B与其已知binding DNA region的结合能力。
: 我的实验方法是：我用293细胞，分两组： 一个做mock transfection，一个转了我的
: 基因A表达质粒。然后我做ChIP（用抗转录因子B蛋白的抗体），用realtime检测转录因
: 子B的已知binding DNA region（看看A的过表达是否改变B与它已知的binding region
: 的binding 能力）。
: 我现在的问题是，我应该如何控制mock transfection 和基因A过表达 这两组的input
: DNA量？我可以通过控制开始的细胞总数一致吗？
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b****r
发帖数: 17995 | 8 是的，overexpression只是第一步，后面肯定要做KD，不然文章估计都发不了
我主要想问的还是ChIP怎么控制input 的问题。我是打算就同时铺细胞，靠细胞总数相
同控制input 总material，不知道是不是可以被接受
起码
【在 O******e 的大作中提到】
: 这个实验设计太粗放了，结果不好解释。你至少要结合knockdown的实验才能大体知道
: 个方向。做overexpression的实验，mock transfection是个非常不好的control.最起码
: 你得转个空质粒做对照。
:
: 力。
: region
: input
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O******e
发帖数: 4845 | 9 作为第一步，我觉得控制细胞总数是可以接受的
【在 b****r 的大作中提到】
: 是的，overexpression只是第一步，后面肯定要做KD，不然文章估计都发不了
: 我主要想问的还是ChIP怎么控制input 的问题。我是打算就同时铺细胞，靠细胞总数相
: 同控制input 总material，不知道是不是可以被接受
:
: 起码
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w********r
发帖数: 1431 | 10 细胞数目大概一样就可以。固定超声之后都取1%的whole cell extract提gDNA，可以测
DNA浓度。剩下的细胞做ChIP，完了以后算IP下来的DNA里，target sequence是1%Input
的多少倍，再根据ctrl IgG算enrichment fold
【在 b****r 的大作中提到】
: 是的，overexpression只是第一步，后面肯定要做KD，不然文章估计都发不了
: 我主要想问的还是ChIP怎么控制input 的问题。我是打算就同时铺细胞，靠细胞总数相
: 同控制input 总material，不知道是不是可以被接受
:
: 起码
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u**********d
发帖数: 573 | 11 fold enrichment可以不用做吧
Input
【在 w********r 的大作中提到】
: 细胞数目大概一样就可以。固定超声之后都取1%的whole cell extract提gDNA，可以测
: DNA浓度。剩下的细胞做ChIP，完了以后算IP下来的DNA里，target sequence是1%Input
: 的多少倍，再根据ctrl IgG算enrichment fold
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