y***y
发帖数: 709 | 1 有一个蛋白，预测到多个磷酸化位点
想看看都什么激酶作用这些位点，不知道kinase profiling是不是能达到这个目的。
看到很多公司有这个sevice，不知板上是否有人用过这个sevice，效果怎么样？那个公
司比较靠谱？大概收费是多少？ |
p*****e
发帖数: 93 | 2 put in GPS 2.1 (a free software), it will tell you the potential kinases.
【在 y***y 的大作中提到】
: 有一个蛋白，预测到多个磷酸化位点
: 想看看都什么激酶作用这些位点，不知道kinase profiling是不是能达到这个目的。
: 看到很多公司有这个sevice，不知板上是否有人用过这个sevice，效果怎么样？那个公
: 司比较靠谱？大概收费是多少？
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y***y
发帖数: 709 | 3 我就是用这个软件预测的磷酸化位点。
可预测出来的潜在位点太多了，我想通过Kinase profiling的方法把作用于这个蛋白的
激酶筛出来。
【在 p*****e 的大作中提到】
: put in GPS 2.1 (a free software), it will tell you the potential kinases.
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S*********s
发帖数: 304 | 4 我觉得你这个jump太多了
至少要先确定是哪个点被phosphorylated了吧？
是不是functional的？
www.phosphosite.org里面可以查查MS data
In vitro kinase profiling我总觉得很不特异
【在 y***y 的大作中提到】
: 我就是用这个软件预测的磷酸化位点。
: 可预测出来的潜在位点太多了，我想通过Kinase profiling的方法把作用于这个蛋白的
: 激酶筛出来。
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y***y
发帖数: 709 | 5 我们已经做了MS确认了几个位点的磷酸化
可是不知道到底是什么激酶磷作用这几个位点
所以我就想，kinase profiling是不是可以把作用这几个位点的激酶筛到
我之前没有接触过激酶这一块的研究，才会来这里问大家
有一个叫taxolx（紫杉醇）的朋友给我来信，告诉我说kinase profiling是指特定激酶
抑制剂的profiling。
我感到很汗颜，连基本概念都没弄清楚-_-!
【在 S*********s 的大作中提到】
: 我觉得你这个jump太多了
: 至少要先确定是哪个点被phosphorylated了吧？
: 是不是functional的？
: www.phosphosite.org里面可以查查MS data
: In vitro kinase profiling我总觉得很不特异
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S*********s
发帖数: 304 | 6 Then you can do
1)in vivo crosslink
可以用非特异的crosslinker
or You can try photo-activated leucine
2)MS identification
【在 y***y 的大作中提到】
: 我们已经做了MS确认了几个位点的磷酸化
: 可是不知道到底是什么激酶磷作用这几个位点
: 所以我就想，kinase profiling是不是可以把作用这几个位点的激酶筛到
: 我之前没有接触过激酶这一块的研究，才会来这里问大家
: 有一个叫taxolx（紫杉醇）的朋友给我来信，告诉我说kinase profiling是指特定激酶
: 抑制剂的profiling。
: 我感到很汗颜，连基本概念都没弄清楚-_-!
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y***y
发帖数: 709 | 7 您可以稍微解释一下您说的in vivo crosslink吗？
我们已经做了MS，并确认了几个位点确实有磷酸化
我坐在这里想象一下：
如果有这么一种slide，上面点着各种不同激酶的特异性抗体，当用激酶的混合物和
slide杂交之后，激酶就会结合在各自的抗体之上，洗掉激酶混合物以及非特异性结合
之后，放在目标蛋白和标记了的ATP溶液中，一段时间后加蛋白交联剂，把和激酶作用
的目标蛋白交联在激酶和抗体复合物上，洗脱，扫片子，有标记信号的点表示该抗体所
对应的激酶们就是目标蛋白磷酸化的激酶。
这个实验能够实现的话，那就是满足我需要的dream experiment。其中最难的应该是蛋
白交联这一步了。如果有公司想研发这种真正的kinase profiling的话，尽管拿这个
idea去研发，我不收专利费，哈哈
【在 S*********s 的大作中提到】
: Then you can do
: 1)in vivo crosslink
: 可以用非特异的crosslinker
: or You can try photo-activated leucine
: 2)MS identification
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S*********s
发帖数: 304 | 8 恩，你还需要做的一件事就是确认那些posphorylation site是重要的，有功能的。
你需要做
knockdown, then rescue with S/T to A mutant and S/T to D/E mutant.
因为很多磷酸化位点虽然发生了，但是没功能。
你想象的想法很好，一不需要抗体，公司一般直接是把tagged kinase放在slide上
二。这个实验很dirty, kinase能磷酸化很多蛋白，特异性不够。
我说的是in vivo crosslink，用你的蛋白把kinase拉下来，但没有那么容易做。
我的感觉是，你需要多读一些kinase研究相关的paper.
Good luck.
【在 y***y 的大作中提到】
: 您可以稍微解释一下您说的in vivo crosslink吗？
: 我们已经做了MS，并确认了几个位点确实有磷酸化
: 我坐在这里想象一下：
: 如果有这么一种slide，上面点着各种不同激酶的特异性抗体，当用激酶的混合物和
: slide杂交之后，激酶就会结合在各自的抗体之上，洗掉激酶混合物以及非特异性结合
: 之后，放在目标蛋白和标记了的ATP溶液中，一段时间后加蛋白交联剂，把和激酶作用
: 的目标蛋白交联在激酶和抗体复合物上，洗脱，扫片子，有标记信号的点表示该抗体所
: 对应的激酶们就是目标蛋白磷酸化的激酶。
: 这个实验能够实现的话，那就是满足我需要的dream experiment。其中最难的应该是蛋
: 白交联这一步了。如果有公司想研发这种真正的kinase profiling的话，尽管拿这个
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b****u
发帖数: 2771 | 9 curious question: what is time scale for kinase and substrate binding.
【在 S*********s 的大作中提到】
: Then you can do
: 1)in vivo crosslink
: 可以用非特异的crosslinker
: or You can try photo-activated leucine
: 2)MS identification
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p*****e
发帖数: 93 | 10 Check whether the phosphorylation sites match the phosphorylation motif of
these potential kinases.
【在 y***y 的大作中提到】
: 我就是用这个软件预测的磷酸化位点。
: 可预测出来的潜在位点太多了，我想通过Kinase profiling的方法把作用于这个蛋白的
: 激酶筛出来。
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S*********s
发帖数: 304 | 11 many kinase/substrate interaction is transient
can not get interaction by IP unless using crosslinker
【在 b****u 的大作中提到】
: curious question: what is time scale for kinase and substrate binding.
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