w******e
发帖数: 1187 | 1 thx a lot for the information!
要问有没有别的位点，自己去Pierce网站上看就行了
Pierce有一个免费的crosslinking handbook（当然是基于它家的产品）
可以pdf下载
也能要他们给你寄free copy
除了连接在哪个位点上要考虑以外
还要考虑考虑链长（spacer length），过长或者过短都有可能影响后续实验（蛋白功
能） |
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D******9
发帖数: 2665 | 2 Is it possible to add the ligand to the cell culture, of couse I know the
cells are responsive to this ligand, then crosslink, IP and send for MASS
SPEC analysis? |
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p****l
发帖数: 291 | 3 yeah, it is really difficult. One of my projects is quite similar.
I finished the step crosslink and IP, and sent the sample for MASS.
But to confirm the receptor is the protein reported by MASS, still need a
lot of time.
I prefer the method you recommended, transfer cDNA library to a cell line
which does not express the receptor. Screen the positive clone. |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 There is back-ward and forward screening methods
For forward screening, you can do crosslinking and pulldown of candidate
proteins, and then send the products for mass spec
For back-ward screenings, you can use random KO library (usually with yeast)
to select the clones that are resistant to your ligand (with proper
screening assay), and then figure out what gene is required for the signal
pathway.
Either way it is not a small work
surface |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 covalent linked by EDC/NHS。想用一种universal的方法（非ELISA）测
beads上link的protein amount。因为beads本身会有interference，想要一种
assay方法，能根据protein amount给出signal，but the signal can't be
together w/ protein, so that the beads can be removed b4 measurement.
any thoughts? Thanks in advance! |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 我们一向都是采用倒推法。
就是看溶液里的蛋白减少了多少。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 thx for the input. I did that too. but when I tried to verify it
by directly measuring the proteins on beads, the result didn't add up... |
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a***e
发帖数: 1010 | 8 crosslink, IP, deep sequencing or RT. |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 打算用biotinylated的RNA probe做一些检测蛋白、核酸相互作用的实验， 加热revers
e crosslink以后
需要用beads把这些RNA probe和直接相互作用的核酸除掉，但是不想碰那些pull-down下
来的蛋白和其他核酸。
Anyway, 简单说，就是用什么浓度的什么detergent可以解决掉蛋白/蛋白和蛋白/核酸的
interaction,
但是不影响核酸/核酸以及biotin/avidin的interaction？ |
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w***a
发帖数: 1053 | 10 最后一个不错，其他的不知道。。。。
myc我用cell signaling 的4b11自己crosslink beads. 也很不错。 |
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V********n
发帖数: 305 | 11 250KD蛋白太大了，如果再来点高级结构很难弄的。这个试验很难搞啊。可以试试UV-
crosslink，然后跑denature的胶。 |
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C***Y
发帖数: 61 | 12
状态，我们文章里面，
overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有
成功，以前就看相关文献，一篇cell
里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连
overexpression这2个蛋白，我们也没检测到
binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。
Hopefully these tips will be helpful.
Make sue you have a very good 1st antibody. A strong antibody is capable of
pulling down weak interaction
partners.
Crosslink 1st antibody to beads and elute co-purified protein complex from beads
after washing (instead of boiling
beads) to reduce background.
Use ECL plu |
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b****u
发帖数: 903 | 13 多谢各位的建议，crosslink我也曾经try过，就是重复不了别人的实验，人家内源也可
以pulldown，咱们overexpressing都不行，差距那叫一个大啊。
BTW，可能不同lab做COIP的时候的buffer条件不一样吧。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 14 想想Chip－chip怎么做的？做Chip多数都是先fix的，
最多加热一下就解crosslink了 |
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e*r
发帖数: 103 | 15 如果解crosslink的话 RNA recovery 能达到做少呢？ |
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h****k
发帖数: 182 | 16 谢ls，如果蛋白本身是单体，使用crosslinking后会不会造成假象，检测结果为dimer
或者multimer??
另外co-IP的时候使用该receptor的抗体，如果是单体，该抗体会不会聚集这些
receptor,而成为dimer或者multimer?? |
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 主要是让蛋白变性沉积，跟covalent bond没啥关系。
http://en.wikipedia.org/wiki/Fixation_%28histology%29
Precipitating fixatives - Alcohols
Precipitating (or denaturing) fixatives act by reducing the solubility of
protein molecules and (often) by disrupting the hydrophobic interactions
that give many proteins their tertiary structure. The precipitation and
aggregation of proteins is a very different process from the crosslinking
that occurs with the aldehyde fixatives.
The most common precipitating fixatives are et... 阅读全帖 |
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s******9
发帖数: 283 | 18 估计你理解错了。30%可能是T%值，8%是C%值（crosslinker的ratio，而不是绝对浓度
）。
C%=5%时，gel的pore size最小，分子筛效应最大。这就是为什么跑蛋白一般用5%的交
联剂。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 HEPES 高温后分子会被水解破坏，对于有些特别严格要求分子式的场合
会有麻烦（比方说作为protein crosslinking buffer)
用来提蛋白的Buffer 嘛，只要pH不变，应该还是可以用的。
所以你最好测一下pH. 如果担心的话就倒了重新配
HEPES 的好处是pH对温度不敏感，Tris在室温和4度的pH 差的很多。
但是HEPES 容易被破坏。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 20 如果是很难做的endogenous CO-IP,不妨先用DSP crosslink一下再做，
虽然很多人鄙视这种corsslink后做出来的CO-IP结果，但只要做好各种control，我觉
得其实也还可以。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 21 能分享一下为什么很多人鄙视crosslink做出的co-IP吗？什么样的control比较好。我
用两种control：1. 没加抗体，只用Protain A/G的resin；2. 用同样动物（兔子）的
IgG，但是是不针对我的体系里任何蛋白的抗体，也就是non-relevant antibody。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 22 “there is possibility that it gets de-activated somehow”
我也觉得是有这个可能，不然这个kit不会要求10 ug左右的抗体。
以前做不用crosslink的做，好像只要1-2 ug就够了。。。
they |
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c*********r
发帖数: 1312 | 23 You are right. 我觉得中间的也是heavy chain。但是我觉得原因是这样的，抗体放久
了有些聚集，crosslink时大部分交联了，部分还是和其它的抗体结合在一起，然后被
我洗脱下来了。我猜是这个原因是因为重复用过几次的Resin再用的话就没有这个现象
了。
rid of the heavy |
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w********r
发帖数: 1431 | 24 是的，你得到了它：）
LZ问题是CO-IP拖不下东西来要怎么优化。
那么用DSP把细胞内的蛋白连一下，一些比较弱或者transient的binding可以被固定住
，比较容易检测一点，也不用费劲去优化各种buffer的条件——虽然很多人看不上这种
CO-IP.
至于你们讨论的抗体和beads crosslink 可以消除IgG chains，但同时会导致抗体结合的效率更加低。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 25 而且分辨率很差， 至少>500bp， 也就是说就是你测到有bind， 这个bind不但可能是
非直接的， 甚至可能都不在你primer的范围内。crosslink大大降低抗体的识别 （即
便多抗也有影响， 说没影响的， 做个WB试试就知道了）， 所以对抗体要求还特别高
（估计要用全长蛋白做的多抗才好一些， 可是现在很多都是用重组肽段做多抗的）。
唯一的好处， 这个算是in vivo， 要是shift assay的话肯定是 in vitro了。 in
vivo的话 应该还可以用luciferase assay + 1.过表达/抑制 TF, 2. 突变/deletion 结合序列 来做， 我倒觉得这个更可
信。 |
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l***y
发帖数: 638 | 26 没crosslink过的膜用这个buffer就彻底白板 |
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C******8
发帖数: 602 | 27 听版上人说做CoImmunoprecipitaion用magnetic beads可以减少nonspecific
手里刚好有active motif ChIP kit里的magnetic protein G beads
我可不可以用这个beads conjugate antibody，然后去拽cell lysate的antigen呀。心
里想差别也就是ChIP里protein先crosslink了DNA嘛。。。
washbuffer还有elution buffer有什么要注意的么？Elution难道直接加sds sample
loading buffer煮一煮，dissociate下来protein到buffer里然后load？
如果新买其它beads还得等几天，试试可不可以呀？有没有前人经验。。。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 28 reverse crosslink这步写得是65度4hr，请问能过夜么？时间过长会有啥后果么
谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 beads 量太小（少于50uL) 可以加适当的blank sepharose beads来填充体积。
管太多的时候就像你说的那样，挺麻烦的，特别是装那么多column很烦，特别
耗时间。不过装完之后就好了，可以把所有column 都装在那种Qiagen rack 上，
一起洗，其实还蛮方便的。我最多的时候同时做过8管。
另外，你指出这个是对的：在大部分情况下的确是可以用IgG 来做loading control。
用这个矫正体积后再跑胶。
我们实验室经常是做crosslinked IgG, 没有办法用这个loading control，
所以我一下子还真没有想到这一点。 |
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j*****a
发帖数: 658 | 30 我觉得你IP， IB 你要检测的蛋白之后，同一张blot再看一下IP的那个蛋白就好了啊。
如果都一致的就无需担心啊。
另外我一般用20ul beads，貌似远远小于大家讨论的量。可我觉得20ul handle 1mg以
下的总蛋白足够了啊。当然这取决于你拉下来的那个蛋白量。我拉的是一个早期信号蛋
白，一种adaptor protein。可能不多。我觉得beads多很annoying，因为会带来非常大
的IgG band。当这个band非常强的的时候会类似屏蔽那种，影响周围方圆几百里的弱信
号。如果你分子量离50不远的话，我觉得70都很费劲。所以我情愿用少一点beads。 当
然如果做那种crosslink beads的就不存在这个问题了可能。我说的是经典ip。不知道
我的想法对不对，请教大家。谢谢。 |
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s********d
发帖数: 156 | 31 这几天正准备做CO-IP/,也顺便请教一下大家。
如果对其中一个蛋白只有一种抗体AVAILABLE,可以IP IB用一样的，都是POLY.有人提议
用MAGNABIND GOAT ANTI-RIBBIT IgG beads(PIERCE)+Ab+CROSSLINKING. 然后LYSATES
也用磁珠PRECLEAR一下，然后一起O/N. 我要看的PROTEIN都在55KD左右。 大家看这
么做合理吗？ |
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y****6
发帖数: 196 | 32 Can anyone explain how fixation works? My understanding is that fixative
helps the crosslink of proteins and other macromolecules. I also have an
impression that it helps the cells to attach to the plate more firmly. It is
correct? |
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w*****n
发帖数: 107 | 33 try crosslink, such as HCHO, then IP |
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n**8
发帖数: 221 | 34 多谢回复，不过crosslink是我想避免的。 |
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n**8
发帖数: 221 | 36 顶一个，
有没有不crosslink， 然后又比较温和的破核的buffer。。。
不甚感激！ |
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i*****g
发帖数: 11893 | 37 用Tris buffer 也可以 无关紧要，最多吸附量低一些.除非下一步做crosslink，Tris buffer 有干扰
beads 有sigma和GE healthcare两种，要买GE healthcare的那种，大概1990s 有人比
较过两种，GE吸附量可以大一倍 |
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m***i
发帖数: 898 | 38 谢谢大家的热心回复。请教如何crosslink抗体？有无具体的protocol? |
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E*********s
发帖数: 93 | 40 Do you know how long I can keep the southern blot after uv crosslink before
hybridation?
The blot is wrapped in filter paper in RT under vaccum, it that the right
condition to store it?
Thanks! |
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I*********r
发帖数: 8 | 41 try crosslinking (maybe followed by mass spec) |
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t****p
发帖数: 1504 | 42 这个不可行。crosslink的效率挺低的，要把一个4蛋白的complex连在一起是几乎不可
能的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
proteolysis by calpain or other proteases.
前者可以用MG132 or beta-lactone
中间可以用100mM NH4Cl
后者可以用calpain inhibitors
MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
是非常明显的。
beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
MG132 专一性稍微好一点点，但是抑制作用不是特别明显。
不管哪个inhibitor 都不能完全解决问题。我不能说你的导师到底是对还是错，
但是你应该找其他方法来佐证。比方说，你可以看看蛋白用这个东西处理的时候，
... 阅读全帖 |
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k*****n
发帖数: 323 | 44 1：1% formaldehyde crosslink 10-20min 应该都不会有太大问题。
2：理论上dna哪一步都不会降解。除非你有dnase的污染。
3：单纯的histone不是很好的检验体系，你可以用polii和h3k4me3或者h3ac的抗体做系
统的阳性对照。 |
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k*****n
发帖数: 323 | 45 你别告诉我你没reverse crosslink就直接跑dna胶了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 46 你也许可以试着transient crosslink,
然后免疫共沉淀， 分析出来的东西再挑几个出来用免疫荧光来重复肯定一下 |
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V********n
发帖数: 305 | 47 多谢。
这个蛋白一般情况下在膜上均匀分布。刺激后聚集。我尝试过刺激前后的细胞抽提膜蛋
白，然后IP，跑电泳，银染色。可惜没有特异性东西出来。如果CROSSLINK，不知道能有多大改善。
IF图片里现象很明显。每次我和老板都对着图片感慨，要是能一刀把聚集区切出来就好
了。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 48 depends on your antibody again. crosslinking will destroy the epitope of the
protein. If you are using polyclonal Ab, you may have more chances |
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D******9
发帖数: 2665 | 49 not completely, we normally use formaldehyde to crosslink the protein.
During this process, you are also destroying the protein to some different
degree. |
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z*******a
发帖数: 175 | 50 又来一sunnyweiwei。
我猜呀，是sunnyday的人气闹的吧。
来一大胆假设，有那末一天，sunnyday呢，贡献过大，功高震主，得一斩立决，就再也没有sunny啥啥的出没了。
然后呢 sunney xie同志受了惊吓，更名换姓，摇身一变成园丁，学Frederick Sanger的啦，很没创意。
sunnyweiwei 呀，听老衲慢慢道来。从前有一小朋友叫zhugeceba，老师说，两点成一线，三点成一面，是公理，不须
证明。小朋友想啊，哇老师厉害，什么都知道。
后来呢，得知有一陈呆子辛苦一辈子论证1＋1＝2，因而zhugeceba糊涂了好一阵。
此处略除一万字。
再..........再后来呢，学习进化论，感觉有意思，来美，上教会，教徒们成天专门针对进化论耐心替我洗脑，－－－更糊涂
啦。
一而再，再而三。
zhugeceba就改名糊涂一世啦
头像是谁呀？拜托赐教 |
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