k******0
发帖数: 1073 | 1 试图纯化protein phosphatase PP1 复合体，蛋白质在1mM DTT （含Mn离子），但过了
3，4天，蛋白质开始沉淀，此时加入更多DTT，蛋白质又稳定了。发现Pp1有13个
cysteine，没有双硫键，可能是这些cysteine crosslink蛋白质。
TCEP可以保持蛋白质更长时间。尝试5mM，不知蛋白质能稳定几天。正在检测中。
有没有xdjm有纯化PP1的经验，如何克服这氧化的问题？是否可以alkylate 这些
cysteine？ 多谢解答。 |
m**z
发帖数: 787 | 2 best solution is to remove oxygen by dialyzing the protein in an anaerobic
chamber with buffers free of oxygen.This is not easy to do though.
【在 k******0 的大作中提到】
: 试图纯化protein phosphatase PP1 复合体，蛋白质在1mM DTT （含Mn离子），但过了
: 3，4天，蛋白质开始沉淀，此时加入更多DTT，蛋白质又稳定了。发现Pp1有13个
: cysteine，没有双硫键，可能是这些cysteine crosslink蛋白质。
: TCEP可以保持蛋白质更长时间。尝试5mM，不知蛋白质能稳定几天。正在检测中。
: 有没有xdjm有纯化PP1的经验，如何克服这氧化的问题？是否可以alkylate 这些
: cysteine？ 多谢解答。
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e****s
发帖数: 1125 | 3 加DTT或者TCEP有什么不好吗？
既然在DTT/TCEP的条件下稳定，就这么提啊。我们实验室提取蛋白一般Buffer都放1-
5mM DTT。如果DTT对下游试验会有干扰，用以前脱盐或者Dialysis就好了。
【在 k******0 的大作中提到】
: 试图纯化protein phosphatase PP1 复合体，蛋白质在1mM DTT （含Mn离子），但过了
: 3，4天，蛋白质开始沉淀，此时加入更多DTT，蛋白质又稳定了。发现Pp1有13个
: cysteine，没有双硫键，可能是这些cysteine crosslink蛋白质。
: TCEP可以保持蛋白质更长时间。尝试5mM，不知蛋白质能稳定几天。正在检测中。
: 有没有xdjm有纯化PP1的经验，如何克服这氧化的问题？是否可以alkylate 这些
: cysteine？ 多谢解答。
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k******0
发帖数: 1073 | 4 没有不好，我只是想蛋白质能够稳定更长时间，在金属离子存在的情况下DTT很快就被
氧化了。蛋白质氧化了引起聚集沉淀。
蛋白质在结晶过程不好不断加还原剂。
【在 e****s 的大作中提到】
: 加DTT或者TCEP有什么不好吗？
: 既然在DTT/TCEP的条件下稳定，就这么提啊。我们实验室提取蛋白一般Buffer都放1-
: 5mM DTT。如果DTT对下游试验会有干扰，用以前脱盐或者Dialysis就好了。
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b******y
发帖数: 627 | 5 DTT and BME are intrinsically unstable in aqueous solution. They will die
out within days. Use TCEP as it is more stable. After crystal trial is setup
, the system will be isolated in terms of O2. Further oxidation is prevented
. If you use high concentration of TECP, make sure to pH it right as it is
very acidic. |
s******y
发帖数: 28562 | 6 赞！
setup
prevented
【在 b******y 的大作中提到】
: DTT and BME are intrinsically unstable in aqueous solution. They will die
: out within days. Use TCEP as it is more stable. After crystal trial is setup
: , the system will be isolated in terms of O2. Further oxidation is prevented
: . If you use high concentration of TECP, make sure to pH it right as it is
: very acidic.
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k******0
发帖数: 1073 | 7 Many thanks.
Will 5mM TCEP is sufficient to last for one month? I use 1 mM at room
temperature for a week by now and the protein is still happy by far.
I use neutralized TCEP solution, so pH would not be an issue.
setup
prevented
【在 b******y 的大作中提到】
: DTT and BME are intrinsically unstable in aqueous solution. They will die
: out within days. Use TCEP as it is more stable. After crystal trial is setup
: , the system will be isolated in terms of O2. Further oxidation is prevented
: . If you use high concentration of TECP, make sure to pH it right as it is
: very acidic.
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b******y
发帖数: 627 | 8 If they are in well capped tubes, sufficient. may even afford to use less,
for instance 1 or 2 mM. good luck. |
b******y
发帖数: 627 | 9 If they are in well capped tubes, sufficient. may even afford to use less,
for instance 1 or 2 mM. good luck. |
